Metabólitu imunomodulatóriu sira maka karakterístika xave ida hosi mikroambiente tumorál (TME), maibé ho exesaun balun, sira nia identidade barak liu maka deskoñesidu. Iha ne'e, ami analiza tumor sira no sélula T sira hosi tumor sira no ascites hosi pasiente sira ho karsinoma serozu ho grau aas (HGSC) hodi revela metaboloma hosi kompartimentu TME oioin sira-ne'e. Ascites no sélula tumorál sira iha diferensa metabólitu ne'ebé luan. Kompara ho ascites, sélula T sira ne'ebé infiltra iha tumor maka enrikese ho signifikativu iha 1-methylnicotinamide (MNA). Maske nivel MNA iha sélula T sira aas, espresaun nikotinamida N-metiltransferase (enzima ida ne'ebé kataliza transferénsia grupu metil sira hosi S-adenosilmetionina ba nikotinamida) limitadu ba fibroblastu sira no sélula tumorál sira. Funsionalmente, MNA induz sélula T sira hodi sekretu sitokina nekroze tumor alfa ne'ebé promove tumor. Tanba ne'e, MNA ne'ebé mai hosi TME kontribui ba regulasaun imunidade hosi sélula T sira no reprezenta alvu imunoterapia potensiál ida ba tratamentu kankru ema nian.
Metabólitu sira ne'ebé mai hosi tumor bele iha efeitu inibidor ne'ebé klean ba imunidade anti-tumor, no evidénsia barak liután hatudu katak sira mós bele sai hanesan forsa xave ba progresaun moras nian (1). Aleinde efeitu Warburg, serbisu foin lalais ne'e hahú ona atu karakteriza estadu metabóliku hosi sélula tumorál sira no ninia relasaun ho estadu imunidade hosi mikroambiente tumorál (TME). Estudu sira kona-ba modelu rate no sélula T ema nian hatudu katak metabolismo glutamina (2), metabolismo oxidativu (3) no metabolismo glicose (4) bele atua independentemente iha subgrupu sélula imunidade oioin. Metabólitu oioin iha dalan sira-ne'e inibi funsaun anti-tumor hosi sélula T sira. Prova ona katak blokeiu hosi koenzima tetrahidrobiopterina (BH4) bele estraga proliferasaun hosi sélula T sira, no aumentu hosi BH4 iha isin bele hasa'e resposta imunidade anti-tumor ne'ebé media hosi CD4 no CD8. Aleinde ne'e, efeitu imunosupresivu husi kynurenina bele hetan salvasaun husi administrasaun BH4 (5). Iha glioblastoma mutante isocitrate dehydrogenase (IDH), sekresaun enantiometabolic (R)-2-hydroxyglutarate (R-2-HG) inibi ativasaun sélula T, proliferasaun no Atividade sitolíze (6). Foin lalais ne'e, hatudu ona katak metilglioksal, produtu sekundáriu ida hosi glikólize, maka produz hosi sélula supresaun sira ho orijen mieloide, no transferénsia sélula T hosi metilglioksal bele inibi funsaun sélula T efetór nian. Iha tratamentu, neutralizasaun metilglioksal nian bele ultrapasa atividade sélula supresor sira ne'ebé mai hosi mieloide (MDSC) no hasa'e ho sinérjiku terapia blokeiu pontu kontrolu nian iha modelu rate nian (7). Estudu sira-ne'e koletivamente subliña papél xave hosi metabólitu sira ne'ebé mai hosi TME iha regulasaun funsaun no atividade sélula T nian.
Disfunsaun sélula T nian relata ona ho luan iha kankru ováriu (8). Ida-ne'e parsialmente tanba karakterístika metabóliku sira ne'ebé inerente iha hipóxia no vaskulatura tumorál ne'ebé la normál (9), ne'ebé rezulta iha konversaun glikóze no triptofanu ba produtu sekundáriu sira hanesan ásidu látiku no kynurenina. Laktadu estraselulár ne'ebé maka barak liu hamenus produsaun interferon-γ (IFN-γ) no dudu diferensiasaun subgrupu mielosupresivu sira (10, 11). Konsumu triptofanu diretamente inibi proliferasaun sélula T no inibi sinál reseptór sélula T (12-14). Maski ho observasaun sira-ne'e, serbisu barak kona-ba metabolismo imunidade hala'o iha kultura sélula T in vitro uza media optimizadu, ka limitadu ba modelu rate omólogu in vivo, ne'ebé la reflete kompletamente heterojeneidade kankru umanu no ambiente makro no mikro fiziolójiku.
Karakterístika komún ida hosi kankru ováriu maka propagasaun peritoneál no mosu ascite. Akumulasaun hosi líkidu sélula nian iha ascites asosiadu ho moras avansadu no prognóstiku ne'ebé ladi'ak (15). Tuir relatóriu sira, kompartimentu úniku ida-ne'e maka hipóksiku, iha nível aas hosi fatór kreximentu endoteliál vaskulár (VEGF) no indoleamine 2,3-dioxigenase (IDO), no infiltradu hosi sélula reguladora T no sélula inibidora mieloide (15-18). Ambiente metabóliku ascite nian bele diferente hosi tumor ne'e rasik, nune'e reprogramasaun hosi sélula T sira iha espasu peritoneál la klaru. Aleinde ne'e, diferensa xave sira no heterojeneidade entre ascite no metabólitu sira ne'ebé prezente iha ambiente tumor nian bele difikulta infiltrasaun sélula imunidade nian no sira nia funsaun iha tumor sira, no presiza peskiza liután.
Atu rezolve problema sira-ne'e, ami dezeña separasaun sélula sensivel no métodu espektrometria massa tandem kromatografia líkidu (LC-MS/MS) hodi estuda tipu sélula oioin (inklui sélula T CD4 + no CD8 +) no mós iha laran no entre tumor sira Ninia metabólitu sira hale'u sélula sira iha ambiente ascite no tumor hanesan pasiente nian. Ami uza métodu ida-ne'e hamutuk ho sitometria fluxu ho dimensaun aas no sekuensiamentu RNA sélula-mesak (scRNA-seq) hodi fornese retratu ida ne'ebé rezolve ho di'ak kona-ba estatutu metabóliku hosi populasaun xave sira-ne'e. Métodu ida-ne'e hatudu aumentu signifikativu iha nível 1-methylnicotinamide (MNA) iha sélula T tumor nian, no esperimentu in vitro hatudu katak efeitu imunomodulatóriu MNA nian iha funsaun sélula T nian uluk deskoñesidu. Jeralmente, métodu ida-ne'e revela interasaun metabóliku mútuo entre tumor sira no sélula imunidade sira, no fornese hanoin úniku sira kona-ba metabólitu sira regulasaun imunidade nian, ne'ebé bele sai útil ba tratamentu imunoterapia kankru ováriu bazeia ba sélula T Oportunidade sira tratamentu nian.
Ami uza sitometria fluxu ho dimensaun aas hodi kuantifika simultaneamente absorsaun glikóze nian [2-(N-(7-nitrophenyl-2-oxa-1,3-diaza-4-yl)amino)-2-deoxyglucose (2-NBDG) no atividade mitokondria [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (MT DR, 2017, 2019) iha sorin markadór típiku sira ne'ebé distinge sélula imunidade no populasaun sélula tumorál sira (Tabela S2 no Figura S1A). Análize ida-ne'e hatudu katak kompara ho sélula T sira, ascites no sélula tumor sira iha nível absorsaun glikosia ne'ebé aas liu, maibé iha diferensa ki'ik liu iha atividade mitokondria. Kaptasaun média glikóze nian hosi sélula tumorál sira [CD45-EpCAM (EpCAM)+] maka dala tolu to'o dala haat hosi sélula T sira, no absorsaun média glikóze nian hosi sélula T CD4 + maka dala 1.2 hosi sélula T CD8 + sira, ne'ebé indika katak linfósitu sira ne'ebé infiltra iha tumor (TIL) iha ezijénsia metabóliku ne'ebé diferente maski iha figura TME ne'ebé hanesan (Figura 1). Iha kontraste, atividade mitokondria iha sélula tumor nian hanesan ho sélula CD4 + T, no atividade mitokondria hosi tipu sélula rua ne'e aas liu duké sélula CD8 + T (Figura 1B). Jeralmente, rezultadu sira-ne'e hatudu nivel metabóliku. Atividade metabóliku husi sélula tumorál aas liu duké sélula CD4 + T, no atividade metabóliku husi sélula CD4 + T aas liu duké sélula CD8 + T. Maski ho efeitu sira-ne'e iha tipu sélula sira, laiha diferensa konsistente iha estatutu metabóliku hosi sélula T CD4 + no CD8 + ka sira nia proporsaun relativu iha ascites kompara ho tumor sira (Figura 1C). Iha kontraste, iha frasaun sélula CD45, proporsaun sélula EpCAM+ iha tumor aumenta kompara ho ascites (Figura 1D). Ami mós observa diferensa metabóliku ne'ebé klaru entre komponente sira sélula EpCAM+ no EpCAM- nian. Sélula EpCAM+ (tumor) iha absorsaun glikóze no atividade mitokondria ne'ebé aas liu duké sélula EpCAM-, ne'ebé aas liu duké atividade metabóliku fibroblastu sira iha sélula tumor iha TME (Figura 1, E no F).
(A no B) Intensidade fluoressénsia mediana (MFI) hosi absorsaun glikóze (2-NBDG) (A) no atividade mitokondria hosi sélula CD4 + T (MitoTracker mean nakukun) (B) Gráfiku reprezentativu sira (karuk) no dadus tabuladu (Loos), sélula CD8 + T no sélula EpCAM + CD45-tumor husi sélula no tumor sira hanesan tumor. (C) Rasio husi sélula CD4 + no CD8 + (husi sélula CD3 + T) iha ascites no tumor. (D) Proporsaun husi sélula tumor EpCAM + iha ascites no tumor (CD45−). (E no F) EpCAM + CD45-tumor no EpCAM-CD45-matrix glucose uptake (2-NBDG) (E) no atividade mitokondria (MitoTracker mean nakukun) (F) gráfiku reprezentativu sira (karuk) no dadus tabuladu (Loos) Ascites no sélula tumorál sira. (G) Gráfiku reprezentativu sira husi espresaun CD25, CD137 no PD1 liuhosi sitometria fluxu. (H no I) espresaun CD25, CD137 no PD1 iha sélula CD4 + T (H) no sélula T CD8 + (I). (J no K) Fenótipu naive, memória sentrál (Tcm), efetór (Teff) no memória efetór (Tem) bazeia ba espresaun CCR7 no CD45RO. Imajen reprezentativu sira (karuk) no dadus tabular (loos) hosi sélula T CD4 + (J) no sélula T CD8 + (K) iha ascites no tumor sira. Valór P sira determina hosi teste t par (*P<0.05, **P<0.01 no ***P<0.001). Liña reprezenta pasiente sira ne'ebé hanesan (n = 6). FMO, fluoresénsia menus ida; MFI, intensidade fluoressénsia mediana.
Análize liután hatudu diferensa signifikativa sira seluk entre estatutu fenotípiku sélula T nian ne'ebé rezolve ho di'ak. Memória ativadu (Figura 1, G to'o I) no efetór (Figura 1, J no K) iha tumor sira maka frekuente liu duké ascite (proporsaun sélula T CD3 +). Nune'e mós, analiza fenótipu liuhosi espresaun hosi markadór ativasaun sira (CD25 no CD137) no markadór sira deplesaun nian [proteína mate sélula programada 1 (PD1)] hatudu katak maski karakterístika metabóliku sira hosi populasaun sira-ne'e diferente (Figura S1, B to'o E), maibé laiha diferensa metabóliku signifikativu ne'ebé maka observa ho konsistente entre efeitu memória nativu, ka subkonjuntu ba memória (Figura S1, F1 HA'U). Rezultadu sira-ne'e hetan konfirmasaun liuhosi uza métodu aprendizajen mákina nian hodi atribui automatikamente fenótipu sélula nian (21), ne'ebé revela liután prezensa hosi númeru boot sélula medula óssea nian (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) iha pasiente nia ascite (Figura S2A ). Entre tipu sélula hotu-hotu ne'ebé identifika ona, populasaun sélula mieloide ida-ne'e hatudu absorsaun glikóze no atividade mitokondria ne'ebé aas liu (Figura S2, B to'o G). Rezultadu sira-ne'e destaka diferensa metabóliku maka'as entre tipu sélula oioin ne'ebé hetan iha ascites no tumor sira iha pasiente HGSC.
Dezafiu prinsipál atu komprende karakterístika metabonómika sira TIL nian maka nesesidade atu izola amostra sira sélula T nian ho pureza, kualidade no kuantidade ne'ebé sufisiente hosi tumor sira. Estudu sira foin lalais ne'e hatudu katak métodu sira klasifikasaun no enrikesimentu kontas nian bazeia ba sitometria fluxu nian bele hamosu mudansa sira iha perfil metabólitu selulár sira (22-24). Atu ultrapasa problema ida-ne'e, ami optimiza métodu enrikesimentu bead nian hodi izola no izola TIL hosi kankru ováriu umanu ne'ebé maka halo resesaun sirúrjika antes halo análize hosi LC-MS/MS (haree Materiál no Métodu sira; Figura 2A). Atu avalia impaktu jerál hosi protokolu ida-ne'e iha mudansa metabólitu sira, ami kompara perfil metabólitu sira hosi sélula T sira ne'ebé ativa hosi doadór saudavel sira hafoin etapa separasaun bead iha leten ho sélula sira ne'ebé la haketak ho bead maibé hela iha jelu leten. Análize kontrolu kualidade ida-ne'e hetan katak iha korelasaun aas entre kondisaun rua ne'e (r = 0.77), no repetibilidade téknika hosi grupu metabólitu 86 iha repetibilidade aas (Figura 2B). Tanba ne'e, métodu sira-ne'e bele hala'o análize metabólitu ne'ebé loos iha sélula sira ne'ebé hetan enrikesimentu tipu sélula nian, nune'e fornese plataforma dahuluk ho rezolusaun aas hodi identifika metabólitu espesífiku sira iha HGSC, nune'e permite ema atu hetan komprensaun kle'an liu kona-ba espesifisidade sélula Programa metabolismo seksuál.
(A) Diagrama eskemátiku hosi enrikesimentu konta magnétika. Molok halo análize liuhosi LC-MS/MS, sélula sira sei hetan enrikesimentu magnétiku ronda tolu tuituir malu ka hela iha jelu leten. (B) Efeitu husi tipu enrikesimentu nian iha abundánsia husi metabólitu sira. Média husi sasukat tolu ba kada tipu enrikesimentu ± SE. Liña kinur reprezenta relasaun 1:1. Korelasaun intra-klase (ICC) husi sasukat repetidu sira ne'ebé hatudu iha rótulu eixu nian. NAD, nikotinamida adenina dinukleotida. (C) Diagrama eskemátiku hosi fluxu serbisu hosi análize metabólitu pasiente nian. Ascites ka tumor sira rekolla hosi pasiente sira no krioprezerva. Porsaun ki'ik ida hosi amostra ida-idak analiza liuhosi sitometria fluxu, enkuantu amostra sira seluk hetan enrikesimentu ronda tolu ba sélula CD4+, CD8+ no CD45-. Frasaun sélula sira-ne'e analiza uza LC-MS/MS. (D) Mapa manas husi abundánsia metabólitu padronizadu. Dendrograma reprezenta agrupamentu Ward nian hosi distánsia Euclidean entre amostra sira. (E) Análize komponente prinsipál (PCA) hosi mapa metabólitu amostra nian, hatudu replikadu tolu hosi amostra ida-idak, amostra sira hosi pasiente ne'ebé hanesan liga hosi liña ida. (F) PCA husi perfil metabólitu husi amostra ne'ebé kondisiona ba pasiente (ezemplu, uza redundansia parsiál); tipu amostra nian limitadu hosi kasko konvexu. PC1, komponente prinsipál 1; PC2, komponente prinsipál 2.
Tuir mai, ami aplika métodu enrikesimentu ida-ne'e hodi analiza metabólitu 99 iha frasaun sira sélula CD4 +, CD8 + no CD45 nian iha ascites no tumor primáriu sira hosi pasiente HGSC na'in-neen (Figura 2C, Figura S3A no Tabela S3 no S4). Populasaun ne'ebé iha interese reprezenta 2% to'o 70% hosi amostra boot orijinál hosi sélula moris sira, no proporsaun hosi sélula sira varia tebes entre pasiente sira. Hafoin haketak kontas sira, frasaun interese ne'ebé enrikesidu (CD4+, CD8+ ka CD45-) reprezenta liu 85% hosi sélula moris hotu-hotu iha amostra iha média. Métodu enrikesimentu ida-ne'e permite ita atu analiza populasaun sélula sira hosi metabolismo tesidu tumor ema nian, ne'ebé imposivel atu halo hosi amostra boot sira. Uza protokolu ida-ne'e, ami determina katak l-kynurenina no adenosina, metabólitu imunosupresivu rua ne'ebé karakterizadu ho di'ak ne'e aumenta iha sélula T tumorál ka sélula tumorál sira (Figura S3, B no C). Tanba ne'e, rezultadu sira-ne'e hatudu fidelidade no abilidade hosi ami nia teknolojia separasaun sélula no espektrometria massa nian hodi hetan metabólitu sira ne'ebé importante biolójikamente iha tesidu pasiente nian.
Ami nia análize mós hatudu separasaun metabóliku maka'as ida hosi tipu sélula sira iha no entre pasiente sira (Figura 2D no Figura S4A). Liuliu, kompara ho pasiente sira seluk, pasiente 70 hatudu karakterístika metabóliku ne'ebé diferente (Figura 2E no Figura S4B), ne'ebé indika katak bele iha heterojeneidade metabóliku substansiál entre pasiente sira. Importante atu nota katak kompara ho pasiente sira seluk (1.2 to'o 2 litru; Tabela S1), kuantidade totál ascites ne'ebé halibur iha pasiente 70 (80 ml) ki'ik liu. Kontrolu ba heterojeneidade entre pasiente sira durante análize komponente prinsipál (ezemplu, uza análize redundansia parsiál) hatudu mudansa konsistente entre tipu sélula sira, no tipu sélula sira no/ka mikroambiente agregadu ho klaru tuir perfil metabólitu (Figura 2F ). Análize ba metabólitu mesak sira subliña efeitu sira-ne'e no hatudu diferensa signifikativa sira entre tipu sélula sira no mikroambiente. Importante atu nota katak diferensa ne'ebé estremu liu ne'ebé observa maka MNA, ne'ebé normalmente riku iha sélula CD45- no iha sélula CD4+ no CD8+ ne'ebé infiltra iha tumor (Figura 3A). Ba sélula CD4 +, efeitu ida-ne'e maka klaru liu, no MNA iha sélula CD8 + parese mós hetan afetadu maka'as hosi ambiente. Maibé, ida-ne'e la importante, tanba pasiente na'in tolu de'it hosi na'in neen maka bele avalia ba pontuasaun CD8+ tumor nian. Aleinde MNA, iha tipu sélula oioin iha ascites no tumor sira, metabólitu sira seluk ne'ebé maka ladún karakteriza iha TIL mós riku ho diferensiál (Figura S3 no S4). Tanba ne'e, dadus sira-ne'e revela konjuntu promisór ida hosi metabólitu imunomodulatóriu sira ba peskiza tuirmai.
(A) Konteúdu normalizadu husi MNA iha sélula CD4+, CD8+ no CD45- husi ascite no tumor. Gráfiku kaixa nian hatudu mediana (liña), luan interkuartil (dobradiça kuadru nian) no luan dadus nian, to'o dala 1.5 hosi luan interkuartil (bigode kuadru nian). Hanesan deskreve iha Materiál no Métodu Pasiente nian, uza pasiente nia valór limma hodi determina valór P (*P<0.05 no **P<0.01). (B) Diagrama eskemátiku hosi metabolismo MNA nian (60). Metabolitu sira: S-adenosyl-1-metionine; SAH, S-adenosina-1-homocysteine; NA, nikotinamida; MNA, 1-methylnicotinamide; 2-PY, 1-metil- 2-piridona-5-karboksamida; 4-PY, 1-metil-4-piridona-5-karboksamida; NR, nicotinamide ribose; NMN, nicotinamide mononucleotide. Enzima sira (verde): NNMT, nikotinamida N-metiltransferase; SIRT, sirtuins; NAMPT, nicotinamide phosphoribosyl transferase; AOX1, aldeídu oxidase 1; NRK, nicotinamide riboside kinase; NMNAT, nicotinamide mono Nucleotide adenylate transferase; Pnp1, fosforilase purina nukleózida. (C) t-SNE husi scRNA-seq husi ascite (kinur) no tumor (mean; n = pasiente na'in 3). (D) Espresaun NNMT iha populasaun sélula oioin ne'ebé identifika uza scRNA-seq. (E) Espresaun husi NNMT no AOX1 iha SK-OV-3, rins embrionáriu umanu (HEK) 293T, sélula T no sélula T ne'ebé trata ho MNA. Espresaun ne'ebé dobrada hatudu relativamente ba SK-OV-3. Padraun espresaun ho SEM hatudu (n = 6 doadór saudavel). Valór Ct sira ne'ebé boot liu 35 konsidera hanesan labele detekta (UD). (F) Espresaun husi SLC22A1 no SLC22A2 iha SK-OV-3, HEK293T, sélula T no sélula T ne'ebé trata ho 8mM MNA. Espresaun ne'ebé dobrada hatudu relativamente ba SK-OV-3. Padraun espresaun ho SEM hatudu (n = doadór saudavel 6). Valór Ct sira ne'ebé boot liu 35 konsidera hanesan labele detekta (UD). (G) Konteúdu MNA sélula nian iha sélula T doadór saudavel ne'ebé ativadu hafoin oras 72 inkubasaun ho MNA. Padraun espresaun ho SEM hatudu (n = 4 doadór saudavel).
MNA produz liuhosi transferénsia grupu metil hosi S-adenosyl-1-metionine (SAM) ba nicotinamide (NA) hosi nicotinamide N-metiltransferase (NNMT; Figura 3B). NNMT maka espresa liu iha kankru umanu oioin no asosiadu ho proliferasaun, invazaun no metástaze (25-27). Atu komprende di'ak liután fonte MNA nian iha sélula T sira iha TME, ami uza scRNA-seq hodi karakteriza espresaun NNMT nian iha tipu sélula sira iha ascites no tumor sira hosi pasiente HGSC na'in tolu (Tabela S5). Análize ba maizumenus sélula 6,500 hatudu katak iha ambiente ascite no tumor, espresaun NNMT hetan restrisaun ba populasaun sélula fibroblastu no tumor ne'ebé presume (Figura 3, C no D). Importante atu nota katak laiha espresaun NNMT ne'ebé klaru iha populasaun ruma ne'ebé espresa PTPRC (CD45 +) (Figura 3D no Figura S5A), ne'ebé indika katak MNA ne'ebé detekta iha espektru metabólitu nian introdús ona iha sélula T sira. Espresaun husi aldeídu oxidase 1 (AOX1) konverte MNA ba 1-metil-2-piridona-5-karboksamida (2-PYR) ka 1-metil-4-piridona-5-karboksamida (4-PYR); Figura 3B) mós restritu ba populasaun fibroblastu sira ne'ebé espresa COL1A1 (Figura S5A), ne'ebé hamutuk indika katak sélula T sira laiha abilidade ba metabolismo MNA konvensionál. Padraun espresaun husi jéniku sira ne'ebé relasiona ho MNA verifika uza konjuntu dadus sélula independente daruak husi ascites husi pasiente HGSC (Figura S5B; n = 6) (16). Aleinde ne'e, análize kuantitativu hosi reasaun kadeia polimeraze (qPCR) hosi sélula T doadór saudavel sira ne'ebé trata ho MNA hatudu katak kompara ho kontrolu sélula tumor ováriu SK-OV-3, NNMT ka AOX1 kuaze la espresa (Figura 3E). Rezultadu sira ne'ebé la espera ne'e indika katak MNA bele sekretu hosi fibroblastu ka tumor sira ba iha sélula T adjasente sira iha TME.
Maske kandidatu sira inklui família transportadór kation orgániku 1 to'o 3 (OCT1, OCT2 no OCT3) ne'ebé kode hosi família portadór soluvel 22 (SLC22) (SLC22A1, SLC22A2 no SLC22A3), transportadór potensiál sira MNA nian seidauk define (28) . QPCR husi mRNA husi sélula T doadór saudavel hatudu nível espresaun ki'ik husi SLC22A1 maibé nível ne'ebé labele detekta husi SLC22A2, ne'ebé konfirma katak ida-ne'e relata ona iha literatura (Figura 3F) (29). Iha kontraste, liña sélula tumor ováriu SK-OV-3 espresa nível aas hosi transportadór rua ne'e (Figura 3F).
Atu koko posibilidade husi sélula T sira ne'ebé iha abilidade atu absorve MNA estranjeiru, sélula T doadór saudavel sira hetan kultura durante oras 72 iha prezensa husi konsentrasaun oioin husi MNA. Iha auzénsia MNA ezojéniu, konteúdu selulár MNA nian labele detekta (Figura 3G). Maibé, sélula T ativadu sira ne'ebé trata ho MNA ezojéniu hatudu aumentu dependente ba doze iha konteúdu MNA iha sélula sira, to'o 6 mM MNA (Figura 3G). Rezultadu ida-ne'e indika katak maski ho nivel espresaun transportadór ne'ebé ki'ik no falta enzima prinsipál ne'ebé responsavel ba metabolismo MNA intraselulár, TIL bele nafatin foti MNA.
Espektru metabólitu sira iha pasiente sira-nia sélula T no esperimentu absorsaun MNA in vitro aumenta posibilidade katak fibroblastu asosiadu ho kankru (CAF) sekretu MNA no sélula tumor bele regula fenótipu no funsaun TIL nian. Atu determina efeitu husi MNA iha sélula T, sélula T doadór saudavel sira ativa in vitro iha prezensa ka auzénsia husi MNA, no sira nia proliferasaun no produsaun sitokina hetan avaliasaun. Hafoin loron 7 aumenta MNA ho doze aas liu, númeru duplikasaun populasaun nian redús ho moderadu, enkuantu vigor mantein iha doze hotu-hotu (Figura 4A). Aleinde ne'e, tratamentu ba MNA ezojéniu rezulta iha aumentu iha proporsaun sélula T CD4 + no CD8 + ne'ebé espresa fatór nekroze tumorál-α (TNFα; Figura 4B). Iha kontraste, produsaun intraselulár IFN-γ nian redús signifikativamente iha sélula CD4 + T, maibé la'ós iha sélula CD8 + T, no laiha mudansa signifikativa iha interleukina 2 (IL-2; Figura 4, C no D). Tanba ne'e, ensaiu imunosorbente ligadu ho enzima (ELISA) hosi supernatante sira hosi kultura sélula T ne'ebé trata ho MNA hatudu aumentu signifikativu iha TNFα, diminuisaun iha IFN-γ, no laiha mudansa iha IL-2 (Figura 4, E to'o G). . Diminuisaun husi IFN-γ indika katak MNA bele iha papél ida hodi inibi atividade anti-tumor husi sélula T sira. Atu simula efeitu husi MNA iha sitotoksisidade mediada husi sélula T, sélula reseptór antíjenu kimériku T (FRα-CAR-T) ne'ebé alvu ba reseptór folate α no CAR-T (GFP) ne'ebé regula husi sélula proteína fluoresente verde (GFP) -CAR-T) produz husi sélula mononukleár raan perifériku doadór saudavel (PBMC). Sélula CAR-T sira hetan kultura durante oras 24 iha prezensa MNA nian, no hafoin ne'e ko-kultiva ho sélula tumor ováriu SK-OV-3 ema nian ne'ebé espresa reseptór folate α iha rásiu efetór ba alvu 10:1. Tratamentu MNA rezulta iha diminuisaun signifikativa iha atividade oho sélula FRα-CAR-T, ne'ebé hanesan ho sélula FRα-CAR-T ne'ebé trata ho adenosina (Figura 4H).
(A) Kontajen totál sélula viável no duplikasaun populasaun (PD) diretamente hosi kultura iha loron 7. Gráfiku barra reprezenta média + SEM hosi doadór saudavel na'in neen. Reprezenta dadus husi pelumenus n = 3 esperimentu independente. (B to'o D) CD3/CD28 no IL-2 uza hodi ativa sélula T sira iha sira nia konsentrasaun MNA ida-idak durante loron 7 nia laran. Molok halo análize, sélula sira hetan estimulasaun ho PMA/ionomycin ho GolgiStop durante oras 4 nia laran. TNFα (B) espresaun iha sélula T sira. Ezemplu imajen (karuk) no dadus tabular (loos) hosi espresaun TNFα iha sélula moris sira. IFN-γ (C) no IL-2 (D) espresaun iha sélula T sira. Espresaun husi sitokina sira sukat liuhosi sitometria fluxu. Gráfiku barra reprezenta média (n = doadór saudavel 6) + SEM. Uza análize ida de'it ba variasaun no sasukat repetidu sira (*P<0.05 no **P<0.01) hodi determina valór P. Reprezenta dadus husi pelumenus n = 3 esperimentu independente. (E to'o G) CD3/CD28 no IL-2 uza hodi ativa sélula T sira iha sira nia konsentrasaun MNA ida-idak durante loron 7 nia laran. Médiu ne'e rekolla antes no depois oras 4 husi estimulasaun PMA/ionomycin. Konsentrasaun sira husi TNFα (E), IFN-γ (F) no IL-2 (G) sukat liuhosi ELISA. Gráfiku barra reprezenta média (n = doadór saudavel 5) + SEM. Valór P determina uza análize ida-de'it hosi variasaun no sasukat repetidu sira (*P<0.05). Liña pontuadu indika limite deteksaun husi deteksaun. (H) Ensaiu lize sélula nian. Sélula FRα-CAR-T ka GFP-CAR-T sira hetan ajustamentu ho adenosina (250μM) ka MNA (10 mM) durante oras 24, ka husik la hetan tratamentu (Ctrl). Persentajen oho husi sélula SK-OV-3 sira sukat ona. Valór P determina hosi teste t Welch (*P<0.5 no **P<0.01).
Atu hetan komprensaun mekanizmu ida kona-ba regulasaun espresaun TNFα ne'ebé dependente ba MNA, mudansa sira iha TNFα mRNA husi sélula T ne'ebé trata ho MNA hetan avaliasaun (Figura 5A). Sélula T doadór saudavel ne'ebé trata ho MNA hatudu aumentu dala rua iha nível transkrisaun TNFα, ne'ebé indika katak MNA dependente ba regulasaun transkrisaun TNFα. Atu investiga mekanizmu regulatóriu posivel ida-ne'e, fatór transkrisaun rua ne'ebé koñesidu ne'ebé regula TNFα, maka fatór nukleár sélula T ativadu (NFAT) no proteína espesífiku 1 (Sp1), hetan avaliasaun hodi hatán ba ligasaun MNA ba promotór TNFα proksimál ( 30). Promotór TNFα kontein fatin ligasaun NFAT 6 ne'ebé identifika ona no fatin ligasaun Sp1 2, ne'ebé sobrepoin iha fatin ida [-55 par baze (bp) husi 5'cap] (30). Imunopresipitasaun kromatina (ChIP) hatudu katak bainhira trata ho MNA, ligasaun Sp1 ba promotór TNFα aumenta dala tolu. Inkorporasaun NFAT nian mós aumenta no hakbesik ba importánsia (Figura 5B). Dadus sira-ne'e indika katak MNA regula espresaun TNFα liuhosi transkrisaun Sp1, no iha medida ki'ik liu espresaun NFAT.
(A) Kompara ho sélula T ne'ebé kuda lahó MNA, mudansa dobra espresaun TNFα iha sélula T ne'ebé trata ho MNA. Padraun espresaun ho SEM hatudu (n = 5 doadór saudavel). Reprezenta dadus husi pelumenus n = 3 esperimentu independente. (B) Promotór TNFα husi sélula T ne'ebé trata ho ka lahó 8 mM MNA hafoin NFAT no Sp1 kombina ho (Ctrl) no estimulasaun PMA/ionomycin durante oras 4 nia laran. Imunoglobulina G (IgG) no H3 uza hanesan kontrolu negativu no pozitivu ba imunopresipitasaun, respetivamente. Kuantifikasaun ChIP hatudu katak ligasaun Sp1 no NFAT ba promotór TNFα iha sélula sira ne'ebé trata ho MNA aumenta dala barak kompara ho kontrolu. Reprezenta dadus husi pelumenus n = 3 esperimentu independente. Valór P determina hosi teste t múltiplu (*** P <0.01). (C) Kompara ho ascites husi HGSC, sélula T (la'ós sitotóxiku) hatudu aumentu espresaun TNF iha tumor. Kór sira reprezenta pasiente oioin. Sélula sira ne'ebé hatudu hetan ona amostra aleatória ba 300 no jittered hodi limita overdrawing (** Padj = 0.0076). (D) Modelu proposta husi MNA ba kankru ováriu. MNA produz iha sélula tumorál sira no fibroblastu sira iha TME no hetan foti hosi sélula T sira. MNA aumenta ligasaun Sp1 nian ba promotór TNFα, hodi hamosu aumentu transkrisaun TNFα no produsaun sitokina TNFα. MNA mós kauza diminuisaun iha IFN-γ. Inibisaun ba funsaun sélula T nian lori ba abilidade oho nian ne'ebé redús no kreximentu tumor nian ne'ebé aselera.
Tuir relatóriu sira, TNFα iha efeitu anti-tumor no anti-tumor ne'ebé dependente ba oin no kotuk, maibé nia iha papél koñesidu ida hodi promove kreximentu no metástaze kankru ováriu nian (31-33). Tuir relatóriu sira, konsentrasaun TNFα iha ascites no tesidu tumorál sira iha pasiente sira ho kankru ováriu aas liu duké iha tesidu benignu sira (34-36). Iha termu mekanizmu, TNFα bele regula ativasaun, funsaun no proliferasaun glóbulu mutin sira, no muda fenótipu sélula kankru nian (37, 38). Konsistente ho deskobrimentu sira-ne'e, análize espresaun jéniku diferensiál hatudu katak TNF hetan regulasaun signifikativa iha sélula T sira iha tesidu tumor nian kompara ho ascites (Figura 5C). Aumentu iha espresaun TNF evidente de'it iha populasaun sélula T ho fenótipu la'ós sitotóxiku (Figura S5A). Iha sumáriu, dadus sira-ne'e suporta hanoin katak MNA iha efeitu duplu imunosupresivu no promotór tumor iha HGSC.
Rotulajen fluoresente bazeia ba sitometria fluxu sai hanesan métodu prinsipál ba estudu metabolismo TIL. Estudu sira-ne'e hatudu katak kompara ho linfósitu sira raan perifériku nian ka sélula T sira hosi órgaun linfoide sekundáriu sira, TIL murinu no ema nian iha tendénsia aas liu atu kapta glikóze (4, 39) no lakon graduál funsaun mitokondria nian (19, 40). Maski ami observa ona rezultadu sira ne'ebé hanesan iha estudu ida-ne'e, dezenvolvimentu xave maka atu kompara metabolismo hosi sélula tumorál sira no TIL hosi tesidu tumorál ne'ebé hanesan. Konsistente ho relatóriu anteriór sira-ne'e balun, sélula tumor (CD45-EpCAM +) hosi ascites no tumor sira iha kaptasaun glikosia aas liu duké sélula CD8 + no CD4 + T, ne'ebé suporta katak kaptasaun glikosia aas hosi sélula tumor bele kompara ho sélula T. Konseitu kompetisaun sélula T nian. TME. Maibé, atividade mitokondria husi sélula tumorál aas liu duké sélula CD8 + T, maibé atividade mitokondria hanesan ho sélula CD4 + T. Rezultadu sira-ne'e reforsa tema ne'ebé mosu katak metabolismo oxidativu importante ba sélula tumorál sira (41, 42). Sira mós sujere katak sélula CD8 + T bele sai suspetivel liu ba disfunsaun oxidativa duké sélula CD4 + T, ka katak sélula CD4 + T bele uza fonte karbonu sira seluk duké glikóze hodi mantein atividade mitokondria (43, 44). Presiza nota katak ami la observa diferensa iha absorsaun glikóze ka atividade mitokondria entre efetór CD4 + T, memória efetór T no sélula memória sentrál T iha ascites. Nune'e mós, estadu diferensiasaun husi sélula T CD8 + iha tumor sira laiha relasaun ho mudansa sira iha kaptasaun glikóze, ne'ebé destaka diferensa signifikativa entre sélula T ne'ebé kuda in vitro no TIL umanu in vivo (22). Observasaun sira-ne'e mós hetan konfirmasaun hosi utilizasaun alokasaun populasaun sélula automátika ne'ebé la iha prejuizu, ne'ebé revela liután katak sélula CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + ho absorsaun glikosia no atividade mitokondria aas liu duké sélula tumorál sira maka prevalente maibé iha populasaun sélula ativu Metabóliku. Populasaun ida-ne'e bele reprezenta subpopulasaun putativa hosi sélula supresaun mieloide ka sélula dendrítika plasmasitoide ne'ebé identifika iha análize scRNA-seq. Maske buat rua ne'e relata ona iha tumor ováriu umanu [45], sira presiza nafatin Serbisu adisionál maka atu deskreve subpopulasaun mieloide ida-ne'e.
Maske métodu sira bazeia ba sitometria fluxu nian bele klarifika diferensa jerál sira iha glikosia no metabolismo oxidativu entre tipu sélula sira, metabólitu sira ne'ebé presiza ne'ebé produz hosi glikosia ka fonte karbonu sira seluk ba metabolismo mitokondria iha TME seidauk determina. Atribui prezensa ka auzénsia hosi metabólitu sira ba subkonjuntu TIL ida presiza purifikasaun hosi populasaun sélula nian hosi tesidu ne'ebé tesi. Tanba ne'e, ami nia métodu enrikesimentu sélula nian kombina ho espektrometria massa nian bele fornese hanoin sira kona-ba metabólitu sira ne'ebé maka enrikese ho diferensiál iha sélula T no populasaun sélula tumor nian iha amostra pasiente sira ne'ebé hanesan. Maske métodu ida-ne'e iha vantajen sira duké klasifikasaun sélula nian ne'ebé ativadu ho fluoresénsia, biblioteka metabólitu balu bele hetan afetadu tanba estabilidade inerente no/ka taxa rotasaun lalais (22). Maski nune'e, ami nia métodu konsege identifika metabólitu imunosupresivu rua ne'ebé rekoñesidu, adenosina no kynurenina, tanba sira varia tebes entre tipu amostra sira.
Ami nia análize metabonómiku ba tumor sira no subtipu TIL nian fornese hanoin barak liután kona-ba papél metabólitu sira nian iha TME ováriu nian. Primeiru, uza sitometria fluxu, ami determina katak laiha diferensa iha atividade mitokondria entre tumor sira no sélula CD4 + T. Maibé, análize LC-MS/MS hatudu mudansa signifikativa sira iha abundánsia metabólitu sira entre populasaun sira-ne'e, ne'ebé indika katak konkluzaun sira kona-ba metabóliku TIL no ninia atividade metabóliku jerál presiza interpretasaun ne'ebé kuidadu. Segundu, MNA maka metabólitu ho diferensa boot liu entre sélula CD45 no sélula T iha ascites, la'ós tumor sira. Tanba ne'e, kompartimentalizasaun no lokalizasaun tumor nian bele iha efeitu oioin ba metabolismo TIL, ne'ebé destaka posivel heterojeneidade iha mikroambiente ida. Terseiru, espresaun hosi enzima produtór MNA NNMT limitadu liuliu ba CAF, ne'ebé maka sélula tumor nian ho medida ne'ebé ki'ik liu, maibé nível MNA ne'ebé bele detekta hetan observasaun iha sélula T ne'ebé mai hosi tumor. Sobre-espresaun NNMT iha CAF ováriu iha efeitu promotór kankru ne'ebé koñesidu, parsialmente tanba promosaun metabolismo CAF, invazaun tumor no metástaze (27). Maske nivel jerál TIL nian moderadu, espresaun NNMT iha CAF iha relasaun besik ho subtipu mesenkimál Cancer Genome Atlas (TCGA), ne'ebé asosiadu ho prognóstiku ne'ebé ladi'ak (27, 46, 47). Ikus liu, espresaun husi enzima AOX1 ne'ebé responsavel ba degradasaun MNA nian mós limitadu ba populasaun CAF, ne'ebé indika katak sélula T sira laiha abilidade atu metaboliza MNA. Rezultadu sira-ne'e suporta ideia katak maski presiza serbisu liután atu verifika deskobrimentu ida-ne'e, nível aas sira MNA nian iha sélula T sira bele indika prezensa hosi mikroambiente CAF imunosupresivu ida.
Haree ba nivel espresaun ki'ik hosi transportadór MNA sira no nível sira ne'ebé labele detekta hosi proteína xave sira ne'ebé envolve iha metabolismo MNA, prezensa hosi MNA iha sélula T sira la espera. NNMT ka AOX1 labele detekta liuhosi análize scRNA-seq no qPCR alvu hosi koorte independente rua. Rezultadu sira-ne'e indika katak MNA la sintetiza hosi sélula T sira, maibé absorve hosi TME ne'ebé hale'u. Esperimentu sira in vitro hatudu katak sélula T sira iha tendénsia atu akumula MNA ezojéniu.
Ami nia estudu in vitro hatudu katak MNA ezojéniu induz espresaun TNFα iha sélula T no hasa'e ligasaun Sp1 ba promotór TNFα. Maske TNFα iha funsaun anti-tumor no anti-tumor, iha kankru ováriu, TNFα bele promove kreximentu kankru ováriu nian (31-33). Neutralizasaun TNFα iha kultura sélula tumor ováriu ka eliminasaun sinál TNFα iha modelu rate bele hadi'a produsaun sitokina inflamatóriu mediadu hosi TNFα no inibi kreximentu tumor (32, 35). Tanba ne'e, iha kazu ida-ne'e, MNA ne'ebé mai hosi TME bele atua hanesan metabólitu pro-inflamatóriu liuhosi mekanizmu dependente ba TNFα liuhosi lasu autokrinu, nune'e promove akontesimentu no propagasaun kankru ováriu nian (31). Bazeia ba posibilidade ida-ne'e, blokeiu TNFα estuda hela hanesan ajente terapéutiku potensiál ba kankru ováriu (37, 48, 49). Aleinde ne'e, MNA prejudika sitotoksisidade hosi sélula CAR-T sira ba sélula tumor ováriu nian, hodi fornese evidénsia liután ba supresaun imunidade mediada hosi MNA. Kolektivamente, rezultadu sira-ne'e sujere modelu ida iha ne'ebé tumor sira no sélula CAF sira sekretu MNA ba TME estraselulár. Liuhusi (i) estimulasaun kreximentu kankru ováriu nian ne'ebé induzidu hosi TNF no (ii) inibisaun atividade sitotóxiku sélula T nian ne'ebé induzidu hosi MNA, ida-ne'e bele iha efeitu tumor duplu (Figura 5D).
Iha konkluzaun, liuhosi aplika kombinasaun ida hosi enrikesimentu rápidu sélula nian, sekuensiamentu sélula ida de'it no perfil metabóliku, estudu ida-ne'e revela diferensa imunometabóliku boot entre tumor sira no sélula ascite nian iha pasiente sira HGSC nian. Análize komprensivu ida-ne'e hatudu katak iha diferensa sira iha absorsaun glikóze no atividade mitokondria entre sélula T sira, no identifika MNA hanesan metabólitu regulador imunidade autónomu la'ós-sélula nian. Dadus sira-ne'e iha impaktu ida kona-ba oinsá TME afeta metabolismo sélula T nian iha kankru umanu sira. Maski kompetisaun direta ba nutriente sira entre sélula T no sélula kankru nian relata ona, metabólitu sira bele mós atua hanesan reguladór indiretu sira hodi promove progresaun tumor nian no karik suprime resposta imunidade endójenu sira. Deskrisaun liután kona-ba papél funsionál hosi metabólitu reguladór sira-ne'e bele loke estratéjia alternativu sira hodi hasa'e resposta imunidade anti-tumor.
Espesímen pasiente sira no dadus klíniku sira hetan liuhosi repozitóriu tesidu tumor kankru BC nian ne'ebé sertifikadu hosi Rede Repozitóriu Tesidu Kanadá nian. Tuir protokolu ne'ebé aprova hosi Komité Étika Peskiza Kankru BC no Universidade British Columbia (H07-00463), pasiente sira-nia espesímen no dadus klíniku hotu-hotu hetan konsentimentu eskrita informadu ka formalmente renunsia sira-nia konsentimentu. Amostra sira rai iha BioBank sertifikadu (BRC-00290). Karakterístika pasiente nian ne'ebé detallu hatudu iha Tabela S1 no S5. Ba krioprezervasaun, bisturi ida uza hodi dekompostu mekanikamente amostra tumor pasiente nian no hafoin dudu liuhosi filtru 100-mikron hodi hetan suspensaun sélula ida de'it. Pasiente nia ascites hetan sentrifugasaun iha 1500 rpm durante minutu 10 iha 4°C hodi halo pelet ba sélula sira no hasai supernatante. Sélula sira ne'ebé hetan hosi tumor no ascites hetan krioprezervasaun iha 50% sérum AB umanu ne'ebé inativa ho manas (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) no 10% dimethyl sulfoxide. Suspensaun sira sélula úniku ne'ebé prezerva ona ne'e deskongela no uza ba metabóliku no determinasaun metabólitu ne'ebé deskreve iha kraik.
Médiu kompletu kompostu husi 0.22 μm filtradu 50:50 suplementadu RPMI 1640: AimV. RPMI 1640 + 2.05 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) suplementadu ho 10% heat-inactivated human AB serum (Sigma-Aldrich), 12.5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific) x1 Solusaun Penisilina Streptomisina (PenStrep) (Thermo Fisher Scientific) no 50 μMB-mercaptoethanol. AimV (Invitrogen) hetan suplementasaun ho 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) no 2 mM l-glutamine (Thermo Fisher Scientific). Tampón kolorasaun sitómetru fluxu nian kompostu husi 0.22μm filtradu fosfatu tampón salina (PBS; Invitrogen) ne'ebé suplementa ho 3% sérum umanu AB inativadu ho manas (Sigma). Tampón enrikesimentu sélula nian kompostu hosi PBS filtradu 0.22μm no suplementa ho sérum AB umanu inativadu ho manas 0.5% (Sigma-Aldrich).
Iha meiu kompletu 37°C, sélula sira hetan ko'a ho 10 nM MT DR no 100 μM 2-NBDG durante minutu 30. Tuir mai, sélula sira hetan ko'a ho tinta viabilidade eF506 iha 4°C durante minutu 15 nia laran. Suspende fali sélula sira iha FC Block (eBioscience) no Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences), dilui iha flow cytometer staining buffer (tuir instrusaun sira fabrikante nian), no inkuba durante minutu 10 iha temperatura ambiente. Kolor sélula sira ho konjuntu antikorpu sira (Tabela S2) iha tampón kolorasaun sitometria fluxu nian iha 4°C durante minutu 20. Suspende fali sélula sira iha tampón kolorasaun sitometria fluxu nian (Cytek Aurora; konfigurasaun 3L-16V-14B-8R) molok halo análize. Uza SpectroFlo no FlowJo V10 hodi analiza dadus kontajen sélula nian, no uza GraphPad Prism 8 hodi kria dadus. Intensidade fluoressénsia mediana (MFI) husi 2-NBDG no MT DR hetan normalizasaun log, no depois uza teste t par ida ba análize estatístika hodi konsidera pasiente sira ne'ebé korresponde. Hasai populasaun hotu-hotu ho eventu menus husi 40 husi análize; hatama valór MFI 1 ba valór negativu ruma molok hala'o análize estatístika no vizualizasaun dadus.
Atu suplementa estratéjia gating manuál husi painél prosesu iha leten, ami uza anotasaun kompletu husi ai-hun restrisaun forma (FAUST) (21) hodi atribui automatikamente sélula sira ba populasaun hafoin halakon sélula mate sira iha FlowJo. Ami jere manualmente saída hodi tau hamutuk populasaun sira ne'ebé parese la aloka sala (kombina PD1+ ho sélula tumor PD1) no populasaun sira ne'ebé mantein. Amostra ida-idak kontein média ida liu 2% sélula sira, ba totál populasaun 11.
Sentrifugasaun ho densidade gradiente Ficoll uza hodi haketak PBMC hosi produtu sira separasaun leukosita nian (STEMCELL Technologies). Sélula CD8 + T sira hetan izolamentu hosi PBMC uza CD8 MicroBeads (Miltenyi) no habelar iha meiu kompletu uza TransAct (Miltenyi) durante semana 2 tuir instrusaun sira fabrikante nian. Sélula sira husik atu hamriik durante loron 5 iha meiu kompletu ne'ebé kontein IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), no hafoin ne'e estimula fali ho TransAct. Iha loron 7, tuir instrusaun sira fabrikante nian, uza CD45 MicroBeads umanu (Miltenyi) hodi enrikese sélula sira iha ronde tolu tuituir malu. Sélula sira hetan alikuota ba análize sitometria fluxu (hanesan deskreve iha leten), no sélula millaun ida hetan alikuota dala tolu ba análize LC-MS/MS. Amostra sira prosesa liuhosi LC-MS/MS hanesan deskreve iha kraik. Ami kalkula valór metabólitu ne'ebé laiha ho númeru ion 1,000. Amostra ida-idak hetan normalizasaun hosi númeru ion totál (TIC), konverte logaritmikamente no normaliza automatikamente iha MetaboAnalystR molok halo análize.
Suspensaun sélula ida de'it hosi pasiente ida-idak deskongela no filtra liuhosi filtru 40 μm ba iha meiu kompletu (hanesan deskreve iha leten). Tuir protokolu fabrikante nian, ronda tolu tuituir malu hosi selesaun pozitivu liuhosi separasaun kontas magnétika uza MicroBeads (Miltenyi) uza hodi enrikese amostra sira ba sélula CD8+, CD4+ no CD45- (iha jelu). Ho liafuan badak, sélula sira suspende fali iha tampón enrikesimentu sélula nian (hanesan deskreve iha leten) no sura. Sélula sira inkuba ho CD8 umanu, CD4 umanu ka CD45 umanu (Miltenyi) iha 4°C durante minutu 15, no hafoin fase ho tampón enrikesimentu sélula nian. Amostra ne'e pasa liuhosi koluna LS (Miltenyi), no rekolla frasaun pozitivu no negativu sira. Atu nune'e bele hamenus durasaun no maximiza etapa rekuperasaun sélula nian, CD8-frasaun uza ba ronda daruak enrikesimentu CD4+ nian, no CD4-frasaun uza ba CD45-enrikesimentu tuirmai. Tau solusaun iha jelu durante prosesu separasaun tomak.
Atu prepara amostra sira ba análize metabólitu, sélula sira fase dala ida ho solusaun masin malirin hanesan jelu, no 1 ml metanol 80% aumenta ba amostra ida-idak, hafoin halo vortex no konjela lalais iha nitrojéniu líkidu. Amostra sira hetan sujeitu ba siklu konjelamentu-deskongelamentu tolu no halo sentrifugasaun iha 14,000 rpm durante minutu 15 iha 4°C. Supernatante ne'ebé kontein metabólitu sira evapora to'o maran. Metabólitu sira disolve fali iha 50 μl husi ásidu fórmiku 0.03%, halo vortex hodi kahur, no hafoin halo sentrifugasaun hodi hasai detritu sira.
Hasai metabólitu sira hanesan deskreve ona iha leten. Transfere supernatante ba botir kromatografia líkidu ho dezempeñu aas ba peskiza metabolómika. Uza protokolu tratamentu aleatóriu ida hodi trata amostra ida-idak ho númeru sélula ne'ebé hanesan hodi prevene efeitu lote nian. Ami hala'o avaliasaun kualitativu ida ba metabólitu globál sira ne'ebé publika ona iha AB SCIEX QTRAP 5500 Triple Quadrupole Mass Spectrometer (50). Análize kromatográfika no integrasaun área piku nian hala'o uza software MultiQuant versaun 2.1 (Applied Biosystems SCIEX).
Kontajen ion 1000 uza hodi kalkula valór metabólitu ne'ebé laiha, no TIC hosi amostra ida-idak uza hodi kalkula área piku normalizadu hosi metabólitu ida-idak ne'ebé detekta hodi hadi'a mudansa sira ne'ebé introdús hosi análize instrumentál hosi prosesamentu amostra. Depois TIC hetan normalizasaun, MetaboAnalystR(51) (parámetru padraun) uza ba konversaun logarítmika no eskala liña norma automátika. Ami uza PCA ho pakote R vegan hodi hala'o análize esploratóriu ba diferensa metabóliku sira entre tipu amostra sira, no uza análize redundansia parsiál hodi analiza pasiente sira. Uza métodu Ward hodi konstrui dendrograma mapa manas nian hodi halibur distánsia Euclidean entre amostra sira. Ami uza limma (52) kona-ba abundánsia metabólitu padronizadu hodi identifika metabólitu sira ne'ebé abundante ho diferensiál iha tipu sélula tomak no mikroambiente. Atu simplifika esplikasaun, ami uza parámetru média grupu nian hodi espesifika modelu, no konsidera tipu sélula sira iha mikroambiente hanesan grupu ida-idak (n = grupu 6); ba teste signifikasaun, ami hala'o sasukat repetidu tolu ba metabólitu ida-idak Atu evita replikasaun falsu, pasiente inklui hanesan obstákulu iha dezeñu limma. Atu bele verifika diferensa sira iha metabólitu sira entre pasiente oioin, ami ajusta modelu limma inklui pasiente sira ho maneira ne'ebé metin. Ami relata signifikasaun hosi kontraste ne'ebé espesifika ona entre tipu sélula no mikroambiente hosi Padj <0.05 (koresaun Benjamini-Hochberg).
Hafoin enrikesimentu vigor uza Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viabilidade), sekuensiamentu transkriptoma sélula-mesak hala'o iha amostra ascite konjeladu moris totál no tumor uza protokolu espresaun jéniku 10x 5′. Kazu lima ho tumor no ascite ne'ebé hanesan hetan analiza, maski viabilidade ki'ik hosi amostra tumor ida prevene nia inkluzaun. Atu bele hetan selesaun múltiplu sira hosi pasiente sira, ami kombina amostra sira hosi pasiente ida-idak iha liña sira hosi kontroladór kromiu 10x, no analiza ascites no fatin tumor nian ketak-ketak. Hafoin halo sekuensiamentu [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp paired end (PE), Quebec genome; média ida husi 73,488 no 41,378 leitura kada sélula ba tumor no ascites respetivamente]], ami uza CellSNP no Vireo (53) (bazeia ba CellSNP hanesan SNP umanu komún (VCF) ne'ebé fornese husi GRCh38 hetan atribuisaun identidade doadór ida. Ami uza SNPRelate atu infere identidade besik liu (IBS) husi pasiente nia jenotipu (IBS) esklui sélula sira ne'ebé la atribui no sélula sira ne'ebé identifika hanesan duplex no doadór sira ne'ebé korresponde entre amostra ascites no tumor (54). (2792 no 4183 sélula sira hosi tumor no ascites, respetivamente) ba análize Ami uza agrupamentu Louvain nian hosi rede viziñu ne'ebé fahe (SNN) bazeia ba distánsia Jaccard nian ba sélula agrupamentu sira tuir espresaun Agrupamentu sira hetan anotasaun manuál ba tipu sélula sira ne'ebé putativu bazeia ba espresaun TNE ne'ebé vizualizadu. sélula sira define hosi espresaun CD8A no GZMA, esklui sub-agrupamentu sira ho espresaun proteína ribosomál ne'ebé ki'ik. Ami asesu ba dadus publikadu hosi Izar et al (16), inklui sira-nia inkorporasaun t-SNE, bele kontrola sobrepozisaun espresaun entre markadór sélula imunidade no espresaun NNMT.
PBMC sira haketak hosi produtu sira separasaun leukosita nian (STEMCELL Technologies) liuhosi sentrifugasaun ho densidade gradiente Ficoll. Sélula CD3 + sira hetan izolamentu hosi PBMC uza kontas CD3 (Miltenyi). Iha prezensa ka auzénsia MNA nian, sélula CD3+ sira ativa ho CD3 ne'ebé liga ba plaka (5μg/ml), CD28 soluvel (3μg/ml) no IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Iha loron ikus espansaun nian, viabilidade (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) no proliferasaun (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) hetan avaliasaun liuhosi sitometria fluxu. Avalia funsaun efetór liuhosi estimula sélula sira ho PMA (20 ng/ml) no ionomycin (1μg/ml) ho GolgiStop durante oras 4, no monitoriza CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) no TNFα-fluoresceinsothianate (TCFIb1), BD). Estimula qPCR no ChIP sélula sira ho PMA (20 ng/ml) no ionomycin (1μg/ml) durante oras 4 nia laran. Supernatante ELISA nian rekolla antes no depois estimulasaun ho PMA (20 ng/ml) no ionomycin (1 μg/ml) durante oras 4 nia laran.
Halo tuir protokolu fabrikante nian hodi izola RNA uza RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN). Uza QIAshredder (QIAGEN) hodi halo amostra sai hanesan. Uza kit RNA ho kapasidade aas ba cDNA (Thermo Fisher Scientific) hodi sintetiza DNA komplementár (cDNA). Uza TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) hodi kuantifika espresaun jéniku (tuir protokolu fabrikante nian) ho sonda sira tuirmai: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs0042755515S, 2012 Hs02786624_g1 [glyceraldehyde-3-phosphate off Hydrogen (GAPDH)] no Hs01010726_m1 (SLC22A2). Amostra sira hala'o iha sistema PCR tempu-reál StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) iha plaka reasaun 96-posu óptiku lalais MicroAmp (Applied Biosystems) ho filme óptiku MicroAmp. Valór Ct ruma ne'ebé liu 35 konsidera hanesan aas liu limite deteksaun no marka hanesan labele detekta.
Halo ChIP hanesan deskreve ona antes (58). Ho liafuan badak, sélula sira hetan tratamentu ho formaldeídu (konsentrasaun finál 1.42%) no inkuba iha temperatura ambiente durante minutu 10. Uza tampón inchaço suplementadu (25 mM Hepes, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl no 0.1% NP-40) iha jelu durante minutu 10, hafoin suspende fali iha tampón imunopresipitasaun hanesan deskreve ona (58 ). Hafoin ne'e, amostra ne'e hetan sonikasaun ho siklu sira tuirmai: siklu 10 (20 pulsa 1-segundu) no tempu estátiku 40 segundu. Inkuba antikorpu sira imunoglobulina G (Teknolojia Sinál Sélula nian; 1μl), histona H3 (Teknolojia Sinál Sélula nian; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) no SP1 (Teknolojia Sinál Sélula nian; 3μl) ho amostra iha 4°CC nakdoko durante kalan tomak. Inkuba kontas proteina A (Thermo Fisher Scientific) ho amostra iha 4°C ho nakdoko ho kmaan durante oras 1, hafoin uza kontas chelex (Bio-Rad) hodi enrikese DNA, no uza proteinase K (Thermo Fisher) ba dijestaun proteína. Promotór TNFα hetan detekta liuhosi PCR: ba oin, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; iha kontráriu, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (produtu 207-bp). Imajen sira ne'e produz hosi Image Lab (Bio-Rad) no kuantifika uza software ImageJ.
Supernatante kultura sélula nian rekolla hanesan deskreve ona iha leten. Determinasaun hala'o tuir prosedimentu sira fabrikante nian hosi kit ELISA TNFα umanu (Invitrogen), kit ELISA IL-2 umanu (Invitrogen) no kit ELISA IFN-γ umanu (Abcam). Tuir protokolu fabrikante nian, supernatante diluídu 1:100 hodi detekta TNFα no IL-2, no 1:3 hodi detekta IFN-γ. Uza EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) hodi sukat absorbánsia iha 450 nm.
PBMC sira haketak hosi produtu sira separasaun leukosita nian (STEMCELL Technologies) liuhosi sentrifugasaun ho densidade gradiente Ficoll. Sélula CD3 + sira hetan izolamentu hosi PBMC uza kontas CD3 (Miltenyi). Iha prezensa ka auzénsia MNA nian, sélula CD3+ sira ativa ho CD3 ne'ebé liga ba plaka (5μg/ml), CD28 soluvel (3μg/ml) no IL-2 (300 U/ml; Proleukin) durante loron 3. Liutiha loron 3, rekolla sélula sira no fase ho 0.9% saline, no pellet ne'e konjela lalais. Kontajen sélula nian hala'o liuhosi sitometria fluxu (Cytek Aurora; konfigurasaun 3L-16V-14B-8R) uza eBeads 123count.
Hasai metabólitu sira hanesan deskreve ona iha leten. Extratu maran ne'e rekonstitui ho konsentrasaun 4000 ekivalente sélula/μl. Analiza amostra liuhosi kromatografia faze-inversa (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) no koluna CORTECS T3 (2.1×150 mm, medida partikula 1.6-μm, medida poru 120-Å; #186008500, Waters). Espektrómetru massa polar (6470, Agilent), iha ne'ebé ionizasaun eletrospray funsiona iha modo pozitivu. Faze móvel A maka 0.1% ásidu fórmiku (iha H2O), faze móvel B maka 90% asetonitrilu, 0.1% ásidu fórmiku. Gradiente LC maka minutu 0 to'o 2 ba 100% A, minutu 2 to'o 7.1 ba 99% B, no minutu 7.1 to'o 8 ba 99% B. Hafoin ekilibra fali koluna ho faze móvel A ho taxa fluxu 0.6 ml/min ba minutu 3. . Taxa fluxu maka 0.4ml/min, no kámara koluna nian manas to'o 50°C. Uza MNA nia padraun kímiku puru (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Canada) hodi estabelese tempu retensaun (RT) no transformasaun (RT = 0.882 minutu, transformasaun 1 = 137→94.1, transformasaun 2 = 137→92 , Konversaun = 17→77). Bainhira tranzisaun tolu hotu akontese iha tempu retensaun ne'ebé loos, tranzisaun 1 uza ba kuantifikasaun hodi asegura espesifisidade. Kurva padraun husi MNA (Toronto Research Chemical Company) maka hamosu husi diluisaun série neen husi solusaun stock (1 mg/ml) hodi hetan padraun 0.1, 1.0, 10 no 100 ng/ml no 1.0 no 10μg/ml respetivamente líkidu. Limite deteksaun maka 1 ng/ml, no resposta lineár maka entre 10 ng/ml no 10μg/ml. Injesaun ida-idak hosi mikrolitru rua hosi amostra no padraun uza ba análize LC/MS, no amostra kontrolu kualidade mistu ida hala'o kada injesaun ualu hodi asegura estabilidade hosi plataforma análize nian. Resposta MNA husi amostra sélula hotu-hotu ne'ebé trata ho MNA iha intervalu linear husi ensaiu. Análize dadus nian halo uza software análize kuantitativu MassHunter (v9.0, Agilent).
Konstrusaun αFR-CAR jerasaun daruak nian foti hosi Song et al. (59). Ho liafuan badak, konstrutu ne'e kontein konteúdu sira tuirmai: sekuénsia líder CD8a, fragmentu variável ho kadeia úniku espesífiku αFR umanu, dobradiça CD8a no rejiaun transmembrana, domíniu intraselulár CD27 no domíniu intraselulár CD3z. Sekuénsia CAR kompletu sintetiza hosi GenScript, no hafoin klona ba iha vetor espresaun lentiviral jerasaun daruak nian iha mota leten hosi kasete espresaun GFP ne'ebé uza hodi avalia efisiénsia transdusaun nian.
Lentivirus produz liuhosi transfesaun husi sélula HEK293T [Kolesaun Kultura Tipu Amerikanu (ATCC); kuda iha Dulbecco nia meiu Eagle modifikadu ne'ebé kontein 10% sérum bovinu feto (FBS) no 1% PenStrep, no uza vetor CAR-GFP no Plasmidu embalajen (psPAX2 no pMD2.G, Addgene) uza amina lipofesaun (Sigma-Aldrich). Supernatante ne'ebé kontein virus rekolla oras 48 no 72 hafoin transfesaun, filtra, no konsentra liuhosi ultrasentrifugasaun. Rai supernatante viral konsentradu iha -80°C to'o transdusaun.
PBMC sira haketak hosi produtu sira separasaun leukosita doadór saudavel nian (STEMCELL Technologies) liuhosi sentrifugasaun ho densidade gradiente Ficoll. Uza selesaun pozitivu CD8 microbeads (Miltenyi) hodi izola sélula CD8+ sira hosi PBMC. Estimula sélula T sira ho TransAct (Miltenyi) no iha meiu TexMACS [Miltenyi; suplementa ho 3% sérum umanu ne'ebé inativadu ho manas, 1% PenStrep no IL-2 (300 U/ml)]. Oras ruanulu-resin-haat hafoin estimulasaun, sélula T sira hetan transdusaun ho lentivirus (10 μl supernatante vírus konsentradu ba kada sélula 106). Loron 1 to'o 3 hafoin transdusaun iha Cytek Aurora (iha FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+), avalia espresaun GFP husi sélula sira hodi hatudu efisiénsia transdusaun pelumenus 30% .
Sélula CAR-T sira hetan kultura durante oras 24 iha Immunocult (STEMCELL Technologies; suplementa ho 1% PenStrep) iha kondisaun sira tuirmai: la hetan tratamentu, hetan tratamentu ho 250 μM adenosina ka 10 mM MNA. Hafoin pré-tratamentu, sélula CAR-T sira fase ho PBS no kombina ho sélula SK-OV-3 20,000 [ATCC; iha meiu McCoy 5A (Sigma-Aldrich) ne'ebé suplementa ho 10% FBS no 1% PenStrep iha 10: Proporsaun efetór ba alvu 1 hetan amplifikasaun iha triplikadu iha meiu Immunocult ne'ebé suplementa. SK-OV-3 sélula sira no SK-OV-3 sélula sira ne'ebé lisa ho digitalis saponin (0.5mg/ml; Sigma-Aldrich) uza hanesan kontrolu negativu no pozitivu, respetivamente. Hafoin oras 24 ko-kultivasaun, rekolla supernatante no sukat lactate dehydrogenase (LDH) tuir instrusaun fabrikante nian (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). Supernatante LDH diluídu 1:50 iha tampón LDH. Persentajen oho nian sukat uza fórmula tuirmai: persentajen oho = persentajen koresaun / taxa oho másimu x 100%, iha ne'ebé persentajen koresaun = ko-kultura-sélula T de'it, no taxa oho másimu = kontrolu pozitivu-kontrolu negativu.
Hanesan deskreve iha testu ka materiál no métodu sira, uza GraphPad Prism 8, Microsoft Excel ka R v3.6.0 ba análize estatístika. Se amostra oioin maka halibur hosi pasiente ne'ebé hanesan (hanesan ascite no tumor), ami uza teste t par ka inklui pasiente hanesan efeitu aleatóriu iha modelu lineár ka jeneralizadu ne'ebé apropriadu. Ba análize metabolómika, teste importánsia hala'o iha triplikadu.
Ba materiál suplementár sira ba artigu ida-ne'e, favór haree http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1
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Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephherson (R.R.R.R. Bellnis), Deraphardnis. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
MNA kontribui ba supresaun imunidade nian hosi sélula T sira no reprezenta alvu imunoterapia potensiál ida ba tratamentu kankru umanu nian.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sarah MacPherson (Sarah MacPherson), Lauren G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), John Stagg (John Stagg), Brad H. Nelson (Brad H. Nelson), Ralph J. Dephherson (R.R.R.R. Bellnis), Deraphardnis. Jones (Russell G. Jones), Phineas T. Hamilton (Phineas T.
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©2021 Asosiasaun Amerikana ba Avansu Siénsia nian. direitu hotu-hotu rezervadu. AAAS hanesan parseiru husi HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef no COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.