Triajen proteína nian iha dalan sekretóriu nian esensiál atu mantein kompartimentalizasaun no omeostaze sélula nian. Aleinde klasifikasaun ne'ebé media hosi kulit, papél hosi lípidu sira iha klasifikasaun kinesin iha prosesu transporte sekretóriu maka pergunta báziku ida ne'ebé kleur ona ne'ebé seidauk hetan resposta. Iha ne'e, ami hala'o imajen 3D multikór simultáneu ho rezolusaun aas iha tempu-reál hodi prova in vivo katak proteína sira ne'ebé foin sintetiza ho glikosilfosfatidilinositol-imobilizadu ho parte lípidu seramida ne'ebé naruk tebes agrupadu no klasifika ba endoplasma espesializadu Net exit site, ne'ebé diferente hosi ida ne'ebé uza hosi proteína transmembrana. Aleinde ne'e, ami hatudu katak komprimentu korrente husi seramida iha membrana retíkulu endoplasmátiku maka krítiku ba seletividade klasifikasaun ida-ne'e. Ami nia estudu fornese evidénsia direta in vivo dahuluk hodi klasifika karga proteína sira bazeia ba komprimentu kadeia lípidu nian ba fatin esportasaun seletivu sira iha dalan sekretóriu.
Iha sélula eukariótika sira, proteína sira ne'ebé sintetiza iha retíkulu endoplasmátiku (ER) hafoin ne'e klasifika durante transporte liuhosi dalan sekretóriu hodi entrega ba sira nia destinu selulár ne'ebé apropriadu (1). Aleinde klasifikasaun mediadu hosi revestimentu, iha ona espekulasaun kleur katak lípidu balu bele mós serve hanesan pontu saída seletivu sira hodi agrupa sira iha domíniu membrana espesífiku sira duké proteína espesífiku sira (2-5). Maibé, iha nafatin falta ida hosi evidénsia in vivo direta atu prova mekanizmu bazeia ba lípidu ne'ebé posivel. Atu rezolve problema báziku ida-ne'e, ami estuda iha fermentu oinsá maka proteína sira ne'ebé maka ankra iha glikosilfosfatidilinositol (GPI) (GPI-APs) esporta ho diferensiál hosi ER. GPI-APs maka variedade ida hosi proteína superfísie sélula nian ne'ebé ligadu ho lípidu ( 6, 7). GPI-AP maka proteína ne'ebé sekretu ne'ebé liga ba folhetu sira liur hosi membrana plasma liuhosi parte glikolípidu (ânkora GPI). Sira simu ânkora GPI sira hanesan modifikasaun pós-translasaun konservativu iha lumen ER (8). Hafoin ligasaun, GPI-AP liu hosi aparellu Golgi (5, 9) hosi ER ba membrana plasma. Prezensa husi ânkora GPI sira kauza GPI-AP atu transporta ketak husi proteína sira ne'ebé sekretu transmembrana (inklui proteína sira seluk husi membrana plasma) tuir dalan sekretóriu (5, 9, 10). Iha sélula fermentu nian, GPI-AP sira haketak hosi proteína sira seluk ne'ebé sekretu iha retíkulu endoplasmátiku, no hafoin ne'e embala iha vesíkula úniku sira ne'ebé taka ho kompleksu proteína II (COPII) (6, 7). Determinante sira hosi prosesu klasifikasaun ida-ne'e iha prosesu esportasaun ER nian la klaru, maibé iha espekulasaun katak mekanizmu ida-ne'e bele presiza lípidu sira, liuliu remodelasaun estruturál hosi porsaun lípidu nian hosi ânkora GPI nian (5, 8). Iha fermentu, remodelasaun lípidu GPI hahú kedas hafoin GPI liga, no iha kazu barak, ida-ne'e kauza seramida atu liga ba ásidu gordura saturadu ho korrente naruk 26-karbonu (C26:0) (11, 12). C26 ceramide maka ceramide prinsipál ne'ebé maka produz hosi sélula fermentu nian to'o agora. Ida-ne'e sintetiza iha ER no barak liu maka esporta ba aparellu Golgi liuhosi vesikula COPII (13). Esportasaun ER husi GPI-AP espesifikamente presiza sínteze seramida ne'ebé la'o hela (14, 15), no iha nia fatin, konversaun seramida ba inositol fosfatu seramida (IPC) iha aparellu Golgi depende ba sínteze ânkora GPI (16). Estudu biofíziku sira ho membrana artifisiál sira hatudu katak serámida sira ho korrente asil ne'ebé naruk tebes bele halibur hamutuk hodi forma domíniu sira ne'ebé ordenadu ho propriedade fíziku sira ne'ebé úniku (17, 18). Dadus sira-ne'e lori ba hipóteze katak C26 ceramide no GPI-AP ho C26 ceramide uza sira nia propriedade fíziku sira hodi halibur iha rejiaun sira ne'ebé ordenadu ka rejiaun sira iha ambiente lípidu membrana ER ne'ebé relativamente dezordenadu. Ida-ne'e kompostu liuliu hosi gliserolípidu badak no insaturadu sira (C16:1 no C18:1) (19, 20). Rejiaun sira-ne'e sei foka seletivamente ba fatin espesífiku sira saída ER nian (ERES), iha ne'ebé seramida no GPI-AP bazeia ba seramida bele ko-transporta ba Golgi iha vesikula COPII dedikadu hanesan (5).
Iha estudu ida-ne'e, ami koko diretamente mekanizmu bazeia ba lípidu ida-ne'e liuhosi uza mikroskopia imajen tempu-reál konfokál super-rezolusaun (SCLIM), ne'ebé maka téknika mikroskopia avansadu ne'ebé bele observa simultaneamente proteína sira ho marka fluoresente Imajen kór tolu no dimensaun tolu (3D) iha rezolusaun aas tebes no velosidade iha sélula moris sira (22, 22).
Ami aplika uluk teknolojia SCLIM hodi define liután oinsá GPI-AP normál ho grupu seramida C26 hetan triajen hosi proteína sira ne'ebé sekreta hosi transmembrana hafoin sai hosi ER iha S. cerevisiae. Atu bele verifika klasifikasaun ER nian, ami uza sistema jenétiku ida ne'ebé bele vizualiza diretamente karga ne'ebé foin sintetiza tama iha ERES in vivo (7, 23). Hanesan karga, ami hili C26 seramida-bazeia GPI-AP Gas1 ne'ebé marka ho proteína fluoresente verde (GFP) no proteína sekreta transmembrana Mid2 ne'ebé marka ho proteína fluoresente infra-mean besik (iRFP), ne'ebé rua ne'e alvu ba membrana plasma (24–26). Iha mutante sec31-1 ne'ebé sensivel ba temperatura, karga rua ne'e espresa iha promotór induzivel ba galaktoza no markadór ERES konstitutivu. Iha temperatura estremu (37°C), tanba mutasaun sec31-1 afeta funsaun komponente COPII Sec31 hodi inibi jerminasaun COPII no esportasaun ER, karga ne'ebé foin sintetiza akumula iha ER (23). Hafoin halo malirin ba temperatura ki'ik (24°C), sélula mutante sec31-1 rekupera hosi área sekretóriu, no karga sintétiku foun ne'ebé akumuladu hahú esporta hosi ER. Vizualizasaun CLIM hatudu katak maioria husi Gas1-GFP no Mid2-iRFP ne'ebé foin sintetiza nafatin akumula iha ER husi sélula mutante sec31-1 hafoin inkubasaun iha 37°C no depois liberta iha 24°C durante minutu 5 (Figura 1). Tanba Mid2-iRFP distribui iha membrana ER tomak, no Gas1-GFP konsentra no halibur iha área membrana ER diskontínua, sira nia distribuisaun kompletamente diferente (Figura 1, A to'o C no Filme S1). Aleinde ne'e, hanesan hatudu iha Figura 1D, agrupamentu Gas1-GFP laiha Mid2-iRFP. Rezultadu sira-ne'e indika katak GPI-AP no proteína transmembrana sira haketak ba rejiaun membrana ER oioin iha inísiu. Agrupamentu Gas1-GFP nian besik ba ERES espesífiku ida ne'ebé marka ho mCherry nia proteína COPII Sec13 (Figura 1, E no F, no filme S1) (23).
sélula sec31-1 sira espresa sekresaun sira ne'ebé induzidu hosi galaktoza, kadeia asil naruk ida (C26) ceramide GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, verde) no proteína transmembrana Mid2-iRFP (TMP, azul) no marka ERES Konstrutivu ida-ne'e Sec13-mCherry (E) inkuza iha RES13°C, 30 minutu, muda ba 24°C, no hasai imajen husi SCLIM minutu 5 liutiha. (A to'o C) hatudu imajen 2D reprezentativu ne'ebé kahur ka úniku hosi planu ida (A), imajen projesaun 2D hosi seksaun z 10 (B) ka imajen hemisfériu sélula 3D hosi karga no markadór ERES (C). Barra eskala 1μm (A no B). Unidade eskala nian maka 0.551μm (C). Gas1-GFP hetan detekta iha rejiaun ka agrupamentu ER diskreta sira, enkuantu Mid2-iRFP hetan detekta no distribui iha membrana ER tomak (C). (D) Gráfiku hatudu intensidade fluoressénsia relativu husi Gas1-GFP no Mid2-iRFP iha agrupamentu Gas1-GFP tuir liña flecha mutin (karuk). AU, unidade arbitráriu. (E no F) reprezenta imajen 3D ne'ebé kombina sasán no marka ERES. Agrupamentu Gas1-GFP hetan detekta besik ERES espesífiku. Unidade eskala nian maka 0.551μm. (F) Seta sólidu mutin marka agrupamentu Gas1-GFP ne'ebé asosiadu ho ERES. Painél sira iha klaran no loos hatudu imajen 3D ne'ebé aumenta no vizaun rotasaun ida hosi agrupamentu Gas1-GFP ne'ebé hili ona.
Relasaun espasiál besik entre agrupamentu Gas1-GFP no ERES espesífiku ida indika katak Gas1-GFP bele tama iha ERES seletivu, ne'ebé diferente hosi seletividade ne'ebé uza hosi Mid2-iRFP hodi sai hosi ER. Atu rezolve posibilidade ida-ne'e, ami kuantifika rasio ERES ba de'it sasán ida ka rua (Figura 2, A to'o C). Ami hetan katak maioria ERES (70%) kontein de'it tipu karga ida. Imajen kraik husi Figura 2C hatudu ezemplu típiku rua husi ERES ho de'it Gas1-GFP (Figura 1) ka de'it Mid2-iRFP (Figura 2). Iha kontraste, maizumenus 20% husi ERES kontein karga rua ne'ebé maka taka malu iha área ne'ebé hanesan. Hetan katak ERES balu (10%) kontein karga tipu rua, maibé sira izoladu iha área sira ne'ebé diferente tebes. Tanba ne'e, análize estatístika ida-ne'e hatudu katak hafoin ER esporta, GPI-AP Gas1-GFP no karga transmembrana Mid2-iRFP fahe ba ERES oioin (Figura 2D). Efisiénsia klasifikasaun ida-ne'e konsistente tebes ho análize biokímika anteriór (6) no determinasaun morfolójiku (7). Ita mós bele observa hahalok karga kuarentena nian ne'ebé tama iha ERES (Figura 2E no Filme S2). Figura 2E hatudu katak porsaun ki'ik ida de'it hosi Gas1-GFP (painél 3) ka Mid2-iRFP (painél 4) tama iha ERES hosi sorin ida no taka iha área diskreta ida. Painél 5 husi Figura 2E hatudu katak Gas1-GFP no Mid2-iRFP dalaruma hetan iha ERES ne'ebé hanesan, maibé sira tama husi sorin ne'ebé la hanesan no konsentra iha rejiaun ketak ne'ebé bele reprezenta vesikula COPII ne'ebé la hanesan. Ami mós konfirma katak separasaun no klasifikasaun ne'ebé observa ona hosi GPI-AP Gas1 bazeia ba seramida C26 hanesan ERES seletivu maka espesífiku tanba karga sekresaun transmembrana seluk, proteína membrana plasma ne'ebé marka ho GFP Axl2 (27 ), hatudu hahalok ne'ebé hanesan ho Mid2-iRFP. (Imajen S1 no Filme S3). Axl2-GFP ne'ebé foin sintetiza distribui liuhosi membrana ER hanesan Mid2-iRFP (Figura S1, A no B), no ko-lokaliza ho Mid2-iRFP iha maioria ERES (Figura S1, B to'o D). Painél 1 no 2 husi Figura 1. S1C hatudu ezemplu típiku rua husi ERES iha ne'ebé karga transmembrana rua taka malu. Iha kazu sira-ne'e, sasán rua ne'e tama hamutuk iha ERES (Figura S1E, Painél 3 no Filme S3).
Sélula sec31-1 ne'ebé espresa sekresaun induzivel galaktoze, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) no Mid2-iRFP (TMP, azul) no ERES konstitutivu ne'ebé marka Sec13-mCherry (ERES, magenta) tau iha 37 Hafoin inkuba durante minutu 30 iha °C 24, liberta ba imajen no blokeia ion ho SCLIM hafoin minutu 20. (A to'o C) Imajen projesaun 2D reprezentativu (A; barra eskala, 1μm) ka imajen hemisfériu sélula 3D (B no C; unidade eskala, 0.456μm) hosi karga no seksaun z 10 ne'ebé marka ho ERES. Painél kraik iha (B) no painél iha (C) hatudu imajen sira ne'ebé prosesa ona hodi hatudu de'it sasán sira ne'ebé prezente iha ERES (magenta) [Gas1-GFP (kinur) no Mid2-iRFP (azul-kro'at)]. (C) Seta nakloke: ERES lori de'it karga ida (1 to'o 4). Seta kinur: ERES kontein karga segregadu (5). Seta sólidu mutin: ERES ne'ebé kontein karga ne'ebé lokaliza hamutuk. Iha kraik: ERES úniku ne'ebé maka hili kontein de'it Gas1-GFP (1) ka Mid2-iRFP (2). Barra eskala nian, 100 nm. (D) Kuantifikasaun husi fotomikrografia ne'ebé deskreve iha (C). Persentajen médiu husi ERES ne'ebé kontein de'it karga ida (Gas1-GFP ka Mid2-iRFP), karga segregadu no karga ne'ebé sobrepoin. Iha esperimentu independente tolu, n=432 iha sélula 54. Barra erru = SD. Teste t la par ho ikun rua. *** P = 0.0002. (E) Imajen 3D husi ERES selesionadu husi karga kuarentena ne'ebé marka ho (C). Gas1-GFP (verde) (3) ka Mid2-iRFP (azul) (4) tama iha ERES (magenta) husi sorin ida no restritu ba área ki'ik ida iha ERES nia laran. Dalaruma, tipu karga rua ne'e tama iha ERES (5) ne'ebé hanesan hosi sorin ne'ebé hanesan no taka metin iha área izoladu ida iha ERES nia laran. Barra eskala nian, 100 nm.
Tuir mai, ami koko hipóteze ida katak seramida ho korrente asil naruk (C26) ne'ebé prezente iha membrana ER nian lori agrupamentu espesífiku no klasifikasaun Gas1 nian ba ERES seletivu. Ba ida-ne'e, ami uza estirpe fermentu nian ne'ebé modifikadu GhLag1, iha ne'ebé sínteze seramida endójena rua Lag1 no Lac1 troka ho GhLag1 (omólogu Lag1 hosi koto), hodi rezulta iha estirpe fermentu ida ho estirpe seramida membrana sélula nian ne'ebé badak liu duké tipu selvajen (Figura 3A) (28). Análize espektrometria massa (MS) hatudu katak iha estirpe tipu selvajen, 95% hosi totál seramida maka seramida ho kadeia naruk tebes (C26), enkuantu iha GhLag1, 85% hosi seramida maka naruk tebes (C18 no C16). ), 2% de'it hosi seramida maka korrente naruk tebes (C26) seramida. Maske C18 no C16 seramida sira maka seramida prinsipál sira ne'ebé detekta iha membrana GhLag1 to'o agora, análize MS mós konfirma katak ânkora GPI husi Gas1-GFP ne'ebé espresa iha estirpe GhLag1 kontein seramida C26, ne'ebé komparavel ho lípidu tipu selvajen. Kualidade hanesan (Fig. 3A) (26). Tanba ne'e, ida-ne'e signifika katak enzima remodelasaun seramida Cwh43 maka seletivu tebes ba seramida C26, hanesan hatudu iha Figura 26, ida-ne'e preferensialmente inkorpora ânkora GPI hosi kuantidade ki'ik seramida C26 iha estirpe GhLag1. S2 (29). Maski nune'e, membrana sélula GhLag1 nian bazikamente kontein de'it seramida C18-C16, enkuantu Gas1-GFP iha nafatin seramida C26. Faktu ida-ne'e halo estirpe ida-ne'e sai hanesan ferramenta ideál ida atu rezolve espesifikamente problema kona-ba komprimentu kadeia asil hosi membrana seramida iha ER. Papél ipotétiku hosi klase no klasifikasaun. Hafoin, ami estuda uluk abilidade C26 Gas1-GFP nian atu akumula iha agrupamentu sira iha GhLag1 ho alelu mutante ida ne'ebé sensivel ba temperatura hosi sec31-1 liuhosi mikroskopia fluoresénsia konvensionál, iha ne'ebé eziste de'it kadeia naruk (C18-C16) iha membrana ER Ceramide (Fig. 3). Ami observa katak iha sec31-1, maioria Gas1-GFP konsentra iha agrupamentu sira, enkuantu Gas1-GFP iha sec31-1 GhLag1 ho membrana ER ceramide naruk (C18-C16) naruk liuliu la agrupadu no distribui iha membrana ER tomak. Atu sai loloos, tanba agrupamentu bazeia ba seramida C26 iha relasaun besik ho ERES espesífiku (Figura 1), tuirmai ami investiga se prosesu ida-ne'e bele mós envolve funsaun hosi mekanizmu esportasaun proteína ER nian. GPI-AP uza sistema COPII espesiál ba esportasaun ER, ne'ebé maka regula ativamente hosi Ted1 nia remodelasaun estruturál hosi porsaun glikanu hosi ânkora GPI (30, 31). GPI-glycan rekombinante hafoin ne'e rekoñese hosi kompleksu reseptór karga transmembrana p24, ne'ebé iha nia fatin rekruta seletivamente Lst1, ne'ebé maka isoforma espesífiku hosi subunidade ligasaun karga COPII prinsipál Sec24, hodi forma COPII riku ho GPI-AP Vesikula sira nesesáriu (31-33). Tanba ne'e, ami konstrui mutante duplu ne'ebé kombina delesaun hosi proteína mesak sira-ne'e (komponente kompleksu p24 Emp24, enzima remodelasaun GPI-glikanu Ted1 no subunidade COPII espesífiku Lst1) ho estirpe mutante sec31-1, no estuda sira Posivel atu forma Gas1-Luster GFP (Figura 33). Ami observa katak iha sec31-1emp24Δ no sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP prinsipalmente la agrupadu no distribui iha membrana ER tomak, hanesan uluk haree iha sec31-1 GhLag1, enkuantu iha sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP Hanesan sec31-1-11. Rezultadu sira-ne'e indika katak aleinde prezensa C26 ceramide iha membrana ER, agrupamentu Gas1-GFP mós presiza atu liga ba kompleksu p24, no la presiza rekrutamentu Lst1 espesífiku. Hafoin, ami esplora posibilidade katak komprimentu korrente husi seramida iha membrana ER bele regula ligasaun husi Gas1-GFP ba p24. Maibé, ami hetan katak prezensa C18-C16 ceramide iha membrana la afeta GPI-glycans ne'ebé rekonstrui hosi kompleksu p24 (Figura S3 no S4, A no B) ka ligasaun ba GPI-AP no esporta GPI-AP. abilidade. Rekruta COPII subtipu Lst1 (Figura S4C). Tanba ne'e, agrupamentu dependente ba seramida C26 la presiza interasaun proteína ho mekanizmu proteína esportasaun ER ne'ebé diferente, maibé suporta mekanizmu klasifikasaun alternativu ne'ebé orienta hosi komprimentu lípidu. Hafoin, ami analiza se komprimentu kadeia asil seramida nian iha membrana ER nian importante ba klasifikasaun efetivu Gas1-GFP nian hanesan ERES seletivu. Tanba Gas1 iha estirpe GhLag1 ho seramida ho kadeia badak sai hosi ER no tama iha membrana plasma (Figura S5), ami fiar katak se klasifikasaun ne'e orienta hosi komprimentu kadeia asil seramida nian, Gas1 iha estirpe GhLag1 bele rediresiona no kruza. Sasan ERES ho membrana hanesan.
(A) Membrana sélula GhLag1 nian liuliu kontein seramida C18-C16 ne'ebé badak liu, enkuantu ânkora GPI Gas1-GFP nian iha nafatin C26 IPC hanesan ho sélula selvajen sira. Iha leten: análize komprimentu kadeia asil husi seramida iha membrana sélula husi estirpe selvajen (Wt) no GhLag1p liuhosi espektrometria massa (MS). Dadus sira reprezenta persentajen hosi seramida totál. Média husi esperimentu independente tolu. Barra erru = SD. Teste t la par ho ikun rua. **** P ＜0.0001. Painél kraik: análize MS hosi komprimentu kadeia asil hosi IPC ne'ebé prezente iha ânkora GPI Gas1-GFP (GPI-IPC) ne'ebé espresa iha estirpe selvajen no GhLag1p. Dadus reprezenta persentajen hosi sinál IPC totál. Média husi esperimentu independente lima. Barra erru = SD. Teste t la par ho ikun rua. ns, la importante. P = 0.9134. (B) Mikrografia fluoressénsia sira hosi sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ no sec31-1lst1Δ sélula sira ne'ebé espresa Gas1-GFP induzidu hosi galaktoza inkuba iha 37°C durante minutu 30 no hala'o ho fluoresénsia rutina mikroskopia hafoin 24°C. Seta mutin: agrupamentu ER Gas1-GFP. Seta nakloke: Gas1-GFP ne'ebé la agrupadu distribui iha membrana ER tomak, hatudu kolorasaun anel nukleár karakterístika ER nian. Barra eskala nian, 5μm. (C) Kuantifikasaun husi fotomikrografia ne'ebé deskreve iha (B). Persentajen médiu hosi sélula sira ho estrutura Gas1-GFP pontuadu. Iha esperimentu independente tolu, n≥300 sélula. Barra erru = SD. Teste t la par ho ikun rua. **** P ＜0.0001.
Atu rezolve diretamente problema ida-ne'e, ami hala'o vizualizasaun SCLIM husi Gas1-GFP no Mid2-iRFP iha GhLag1 ho alelu mutante sensivel ba temperatura sec31-1 (Figura 4 no Filme S4). Hafoin ER mantein iha 37°C no tuirmai liberta iha 24°C, maioria hosi Gas1-GFP ne'ebé foin sintetiza la agrupa no distribui iha membrana ER tomak, hanesan observa hosi mikroskópiu konvensionál sira (Figura 4, A no B ). Aleinde ne'e, persentajen boot ida hosi ERES (67%) inklui tipu karga rua ne'ebé lokaliza hamutuk iha laran (Figura 4D). Painél 1 no 2 husi Figura 4C hatudu ezemplu típiku rua husi ERES ho Gas1-GFP no Mid2-GFP ne'ebé sobrepoin. Aleinde ne'e, sasán rua ne'e rekruta iha ERES ne'ebé hanesan (Figura 4E, painél 3 no filme S4). Tanba ne'e, ami nia rezultadu sira indika katak komprimentu hosi kadeia asil seramida iha membrana ER maka determinante importante ida hosi agregasaun no klasifikasaun proteína ER nian.
Sec31-1 GhLag1 sélula sira ne'ebé espresa sekresaun sira ne'ebé induzidu hosi galaktoza, Gas1-GFP (GPI-AP, verde) no Mid2-iRFP (TMP, azul) no konstitutivu ERES-labeled Sec13-mCherry (ERES, magenta) Inkuba iha 37°C. Kontinua durante minutu 30, tun ba 24°C hodi hasai sekresaun sira, no halo imajen ho SCLIM hafoin minutu 20. (A to'o C) Imajen projesaun 2D reprezentativu (A; barra eskala, 1μm) ka imajen hemisfériu sélula 3D (B no C; unidade eskala, 0.45μm) hosi seksaun-z 10 ne'ebé marka ho karga no ERES. Painél kraik iha (B) no painél iha (C) hatudu imajen sira ne'ebé prosesa ona hodi hatudu de'it sasán sira ne'ebé prezente iha ERES (magenta) [Gas1-GFP (kinur) no Mid2-iRFP (azul-kro'at)]. (C) Seta mutin ne'ebé nakonu: ERES, sasán sira taka malu. Seta loke: ERES kontein de'it sasán ida. Painél kraik: ERES ne'ebé maka hili iha sasán sira ne'ebé maka sobrepoin (1 no 2) ne'ebé maka marka iha (C). Barra eskala nian, 100 nm. (D) Kuantifikasaun husi fotomikrografia ne'ebé deskreve iha (C). Iha unidade sec31-1 no sec31-1 GhLag1, inklui de'it karga ida (Gas1-GFP ka Mid2-iRFP), no persentajen médiu ERES nian ba karga izoladu no karga ne'ebé sobrepoin malu. Iha esperimentu independente tolu, n = 432 iha sélula 54 (sec31-1) no n = 430 iha sélula 47 (sec31-1 GhLag1). Barra erru = SD. Teste t la par ho ikun rua. *** P = 0.0002 (sec31-1) no ** P = 0.0031 (sec31-1 GhLag1). (E) Imajen 3D husi ERES ne'ebé maka hili ho karga ne'ebé maka sobrepoin (3) ne'ebé maka marka iha (C). Gas1-GFP (verde) no Mid2-iRFP (azul) hakbesik ba ERES (magenta) husi sorin ne'ebé hanesan no hela iha área restrita ERES ne'ebé hanesan. Barra eskala nian, 100 nm.
Estudu ida-ne'e fornese evidénsia direta in vivo katak karga proteína bazeia ba lípidu sira klasifika iha fatin esportasaun seletivu sira iha dalan sekretóriu, no revela importánsia hosi komprimentu kadeia asil ba seletividade klasifikasaun nian. Uza téknika mikroskopia ida ne'ebé maka'as no avansadu ho naran SCLIM, ami hatudu Gas1-GFP ne'ebé foin sintetiza (GPI-AP membrana plasma prinsipál ida ho porsaun lípidu seramida kadeia asil (C26) ne'ebé naruk tebes) iha fermentu) Rejiaun sira ne'ebé halibur iha ER diskreta sira asosiadu ho ERES espesífiku, enkuantu proteina transmembrana sira distribui liuhosi membrana ERRES (Figura 1). Aleinde ne'e, tipu sasán rua ne'e tama iha ERES ne'ebé diferente ho seletivu (Figura 2). Komprimentu kadeia asil husi seramida selulár iha membrana redús husi C26 ba C18-C16, agrupamentu Gas1-GFP hetan perturbasaun ba rejiaun ER diskreta, no Gas1-GFP hetan enkamiña fali hodi sai husi ER ho proteína transmembrana liuhosi ERES hanesan (Figura 3 no Figura 3). 4).
Maske GPI-AP uza mekanizmu proteína espesializadu ida hodi sai hosi ER, ami hetan katak separasaun dependente ba seramida C26 la depende ba interasaun proteína diferensiál ne'ebé bele lori ba espesializasaun ERES (Figura S4 no S5). Envezde, ami nia deskobrimentu sira suporta mekanizmu klasifikasaun alternativu ida ne'ebé maka dudu hosi agrupamentu proteína bazeia ba lípidu no eskluzaun tuirmai hosi karga sira seluk. Ami nia observasaun sira indika katak rejiaun Gas1-GFP ka agrupamentu ne'ebé asosiadu ho ERES espesífiku ida laiha proteína sekretu transmembrana Mid2-iRFP, ne'ebé indika katak agrupamentu GPI-AP dependente ba seramida C26 sei fasilita sira nia entrada ba ERES relevante, no iha tempu hanesan, esklui transmembrana Sekresaun sira tama iha ERES partikulár ida-ne'e (Figura 12 no RES). Iha kontraste, prezensa C18-C16 ceramides iha membrana ER la kauza GPI-AP atu forma rejiaun ka agrupamentu sira, nune'e sira la esklui ka troka proteína sira ne'ebé sekreta hosi transmembrana ba ERES hanesan (Figura 3 no 4). . Tanba ne'e, ami propoin katak C26 ceramide lori separasaun no klasifikasaun liuhosi fasilita agrupamentu proteína sira ne'ebé liga ba ERES espesífiku.
Oinsá atu atinji agrupamentu dependente ba seramida C26 ida-ne'e iha área ER espesífiku ida? Tendénsia husi membrana seramida atu haketak lateralmente bele kauza GPI-AP no C26 seramida atu forma lípidu ki'ik no ordenadu instantaneamente iha ambiente lípidu irregulár liu husi membrana ER ne'ebé kontein gliserolípidu badak no insaturadu. Agrupamentu kualidade sira (17, 18). Agrupamentu temporáriu ki'ik sira-ne'e bele fuze liután ba agrupamentu boot liu, no estável liu hafoin liga ba kompleksu p24 (34). Konsistente ho ida-ne'e, ami hatudu katak C26 Gas1-GFP presiza atu interaje ho kompleksu p24 hodi forma agrupamentu vizivel ne'ebé boot liu (Figura 3). Komplexu p24 maka oligómeru heterozigotu ne'ebé kompostu hosi proteína transmembrana p24 haat ne'ebé diferente iha fermentu (35), ne'ebé fornese ligasaun multivalente, ne'ebé bele hamosu ligasaun kruzada hosi agrupamentu GPI-AP ki'ik sira, nune'e hamosu agrupamentu Estavel ne'ebé boot liu (34). Interasaun entre ektodomíniu proteína sira GPI-AP nian bele mós kontribui ba sira nia agregasaun, hanesan hatudu durante sira nia transporte Golgi iha sélula epiteliál polarizadu mamíferu sira (36). Maibé, bainhira C18-C16 ceramide prezente iha membrana ER, bainhira kompleksu p24 liga ba Gas1-GFP, agrupamentu ketak boot sira sei la forma. Mekanizmu subjasente bele depende ba propriedade fíziku no kímiku espesífiku sira hosi seramida ho korrente asil naruk. Estudu biofíziku sira kona-ba membrana artifisiál sira hatudu katak maski seramida sira ho korrente asil naruk (C24) no badak (C18-C16) bele kauza separasaun faze, só seramida sira ho korrente asil naruk (C24) maka bele promove Kurvatura aas no dobramentu filme nian hodi forma fali filme. Liuhusi referénsia mútua (17, 37, 38). Hatudu ona katak hélice transmembrana husi TMED2, omólogu umanu husi Emp24, interasaun seletivamente ho esfingomielina bazeia ba seramida C18 iha lóbulu sitoplazmátiku sira (39). Uza simulasaun dinámika molekulár (MD), ami hetan katak tantu C18 no C26 ceramides akumula iha lóbulu sitoplazmátiku sira hosi hélice transmembrana Emp24 nia sorin, no sira iha preferénsia ne'ebé hanesan (Figura S6). Importante atu nota katak ida-ne'e indika katak hélice transmembrana Emp24 nian bele hamosu distribuisaun asimétriku hosi lípidu sira iha membrana. Ida-ne'e maka rezultadu foin lalais ne'e bazeia ba sélula mamíferu sira. Simulasaun MD ne'ebé hanesan mós hatudu prezensa husi lípidu éter (40) . Tanba ne'e, ami espekula katak C26 ceramide iha lóbulu rua ER26 nian maka enrikese lokalmente. Bainhira GPI-AP iha lóbulu luminal sira liga diretamente ba p24 multivalente no akumulasaun seramida C26 nian iha p24 nia sorin iha lóbulu sitoplazmátiku sira, ida-ne'e bele promove akompañamentu Agregasaun proteína no kurvatura membrana nian ne'ebé maka hamosu liuhosi liman-fuan sira (41), hodi halo GPI-AP haketak ba rejiaun diskreta sira ne'ebé besik ba ERES, ne'ebé mós favorese rejiaun sira ne'ebé kurva aas membrana ER (42). Relatóriu anteriór sira apoia mekanizmu ne'ebé propoin (43, 44). Ligasaun multivalente husi oligolektina sira, patojéniku sira ka antikorpu sira ba glikosfingolípidu sira (GSL) bazeia ba seramida iha membrana plasma nian hamosu agregasaun GSL ne'ebé boot, hasa'e separasaun faze nian no kauza deformasaun no internalizasaun membrana nian (44). Iwabuchi nsst. (43) Hetan katak iha prezensa hosi korrente asil naruk (C24) maibé la'ós badak (C16), ligandu multivalente ne'ebé liga ba laktosilseramida GSL induz formasaun hosi agrupamentu boot sira no invajinasaun membrana nian, no transdusaun sinál mediadu hosi sitoplasma Lyn iha folletu sira ne'ebé interita hosi korrente asil neutrofilu kaben sira.
Iha sélula epiteliál polarizadu mamíferu sira, konsentrasaun hosi rede anti-Golgi (TGN) ba nivel hosi membrana plasma apikál kontrola separasaun no klasifikasaun hosi GPI-AP (10, 45). Agregasaun ida-ne'e maka impulsiona hosi oligomerizasaun GPI-AP (36), maibé bele mós depende ba komprimentu kadeia seramida nian ne'ebé ita hetan iha fermentu. Maske GPI-AP mamíferu nian iha ânkora ida ne'ebé bazeia ba lípidu éter, no nia estrutura kímika diferente tebes hosi kadeia asil ne'ebé naruk tebes, estudu ida foin lalais ne'e hetan katak lípidu rua ne'e iha propriedade no funsaun fíziku no kímiku ne'ebé hanesan iha evolusaun (40). Tanba ne'e, parte lípidu éter iha sélula mamíferu sira bele hanesan ho C26 ceramide iha fermentu, no nia papél maka atu asosia ho ceramide ho kadeia naruk iha membrana hodi promove agregasaun no klasifikasaun GPI-AP. Maski posibilidade ida-ne'e presiza nafatin atu koko diretamente, deskobrimentu anteriór sira apoia katak transporte hosi seramida ho kadeia asil naruk ba isin Golgi nian la'ós hala'o hosi proteína transferénsia sitoplazmátiku sira, maibé depende ba sínteze hosi âncora sira GPI nian hanesan fermentu. Tanba ne'e, mekanizmu konservadór evolutivu parese bele ko-transporta ho seletivu seramida ho kadeia asil ne'ebé naruk tebes no GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) iha vesikula transporte ne'ebé hanesan.
Iha sistema sélula epiteliál polarizadu fermentu no mamália nian, agregasaun GPI-AP no separasaun hosi proteína membrana plasma sira seluk akontese hotu molok to'o iha superfísie sélula nian. Paladino et al. (48) hetan katak iha TGN husi sélula epiteliál polarizadu mamália nian, agrupamentu GPI-AP la'ós de'it nesesáriu ba klasifikasaun seletivu husi GPI-APs ba membrana plasma apikál, maibé mós regula organizasaun agrupamentu husi GPI-APs no Ninia atividade biolójiku. Superfísie sélula nian. Iha fermentu, estudu ida-ne'e hatudu katak agrupamentu GPI-AP ne'ebé dependente ba seramida C26 iha ER bele regula organizasaun agrupamentu no atividade funsionál GPI-AP nian iha membrana plasma (24, 49). Konsistente ho modelu ida-ne'e, sélula GhLag1 sira alerjia ba inibidor GPI ka ai-moruk sira ne'ebé afeta integridade parede sélula nian (28), no nesesidade ba agrupamentu Gas1-GFP funsionál (49) hosi ponta seramida ne'ebé projeta iha kaben sélula fermentu nian indika G Konsekuénsia fiziolójiku posivel sira hosi sélula hLag1. Erru GPI-AP. Maibé, teste liután se organizasaun funsionál hosi superfísie sélula nian programa ona hosi ER liuhosi métodu klasifikasaun ida bazeia ba komprimentu lípidu nian sei sai hanesan asuntu hosi ami nia peskiza iha futuru.
Estirpe Saccharomyces cerevisiae ne'ebé uza iha serbisu ida-ne'e lista iha Tabela S1. Estirpe MMY1583 no MMY1635 husi SCLIM ba imajen sélula moris nian konstrui iha fundo husi W303. Estirpe sira-ne'e ne'ebé espresa Sec13-mCherry ho tag proteína fluoresente ida konstrui uza métodu bazeia ba reasaun kadeia polimeraze (PCR) ho plásmidu pFA6a hanesan modelu (23). Estirpe ne'ebé espresa Mid2-iRFP ne'ebé marka ho proteína fluoresente iha kontrolu hosi promotór GAL1 nian konstrui hanesan tuirmai. Amplifikasaun PCR husi sekuénsia iRFP-KanMx husi vetor pKTiRFP-KAN (prezente husi E. O'Shea, númeru plásmidu Addgene 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; identifikadór rekursu peskiza (RRID): Addgene_64687) No hatama iha endójenu C2. Hafoin sekuénsia jenoma Mid2-iRFP hetan amplifikasaun no klona iha promotór GAL1, ida-ne'e integra iha fatin Not I-Sac I hosi plasmide integrasaun pRS306. Plasmide pRGS7 ne'ebé rezulta hetan linearizasaun ho Pst I hodi integra iha lokus URA3.
Jene fuzaun Gas1-GFP espresa iha kontrolu hosi promotór GAL1 iha plásmidu sentrómeru (CEN), ne'ebé konstrui hanesan tuirmai. Sekuénsia Gas1-GFP hetan amplifikasaun liuhosi PCR hosi plásmidu pRS416-GAS1-GFP (24) (prezente hosi L. Popolo) no klona iha fatin Xma I–Xho I hosi plásmidu CEN pBEVY-GL LEU2 (prezente hosi C). Miller; Addgene plasmid number 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Plasmide ne'ebé rezulta hanaran pRGS6. Jene fuzaun Axl2-GFP mós espresa iha kontrolu hosi promotór GAL1 hosi vetor pBEVY-GL LEU2, no nia konstrusaun maka hanesan tuirmai. Sekuénsia Axl2-GFP hetan amplifikasaun hosi plásmidu pRS304-p2HSE-Axl2-GFP (23) liuhosi PCR, no klona iha fatin Bam HI-Pst I hosi vetor pBEVY-GL LEU2. Plasmide ne'ebé rezulta hanaran pRGS12. Sekuénsia husi oligonukleotida sira ne'ebé uza iha estudu ida-ne'e lista iha Tabela S2.
Estirpe ne'e hetan suplementasaun ho 0.2% adenina no 2% glikosia [YP-dextrose (YPD)], 2% rafinoza [YP-rafinoza] riku ho extratu fermentu proteina p (YP) médiu (1 % Extratu fermentu no 2% proteina ept). (YPR)] ka 2% galaktosa [YP-galactose (YPG)] hanesan fonte karbonu, ka iha meiu mínimu sintétiku (0.15% baze nitrojéniu fermentu no 0.5% sulfatu amóniu) hodi suplementa aminoásidu no baze apropriadu sira ne'ebé presiza ba nutrisaun, No kontein 2% glukoze (meiu glikótiku) ka meiu mínimu galaktosa (meiu mínimu galaktosa sintétiku) hanesan fonte karbonu.
Ba imajen iha tempu-reál, sélula mutante sec31-1 ne'ebé sensivel ba temperatura ne'ebé espresa konstrusaun iha promotór GAL1 nia okos kuda iha meiu YPR iha 24°C durante kalan to'o faze mid-log. Hafoin indusaun iha YPG iha 24°C durante oras 1, sélula sira inkuba iha SG iha 37°C durante minutu 30, no depois transfere ba 24°C hodi hasai hosi bloku sekresaun. Concanavalin A uza hodi hadi'a sélula sira iha vidru ida no hetan imajen hosi SCLIM. SCLIM maka kombinasaun ida hosi mikroskópiu fluoressénsia invertida Olympus IX-71 no lente mina-rai ho abertura numérika UPlanSApo 100×1.4 (Olympus), eskaner konfokál disko rotasaun ho velosidade aas no sinál-ba-ruídu ho rasio aas (Yokogawa Electric), espektrómetru personalizadu, imajen intensifikadór sira (Hamamatsu Photonics) bele fornese sistema lente aumenta ho magnifikasaun finál ×266.7 no kámara dispozitivu ida ne'ebé akopla ho karga ne'ebé multiplika eletrón sira (Hamamatsu Photonics) (21). Akizisaun imajen nian hala'o hosi software personalizadu (Yokogawa Electric). Ba imajen 3D sira, ami uza atuador piezoelétriku ne'ebé halo tuir pedidu hodi halo vibrasaun ba lente objetivu vertikál, no halibur parte ótika sira ho distánsia 100 nm iha pilha ida. Imajen Z-stack nian konverte ba dadus voxel 3D, no funsaun espallamentu pontu teóriku ne'ebé uza ba mikroskópiu konfokál disk rotasaun nian uza ba prosesamentu dekonvolusaun hosi software Volocity (PerkinElmer). Hodi uza software Volocity hodi automatikamente limite ba análize ko-lokalizasaun, ERES inklui karga hetan sukat. Análize liña nian hala'o uza software MetaMorph (Molecular Devices).
Uza software GraphPad Prism atu determina signifikasaun estatístika. Ba teste t Student nian ho parte rua no teste análize variasaun (ANOVA) baibain, diferensa sira entre grupu sira konsidera iha impaktu signifikativu ba P <0.05 (*).
Ba mikroskopia fluoressénsia Gas1-GFP nian, sélula faze log nian sira kuda durante kalan iha YPD no halibur liuhosi sentrifugasaun, fase dala rua ho salina fosfatu, no inkuba iha jelu durante pelumenus minutu 15, no hafoin ne'e kontinua iha mikroskópiu nia okos hanesan deskreve ona antes Verifika (24). Mikroskópiu Leica DMi8 (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) ne'ebé ekipadu ho lente objetivu, filtru L5 (GFP), kámara Hamamatsu no software Application Suite X (LAS X) uza ba akizisaun. .
Amostra sira hetan desnaturasaun ho tampón amostra SDS iha 65°C durante minutu 10, no hafoin ne'e haketak liuhosi eletroforeze gel SDS-poliakrilamida (PAGE). Ba análize imunoblotting, 10 μl husi amostra maka karrega ba kada liña. Antikorpu primáriu: Uza anti-Gas1 poliklonál koelhu nian ho diluisaun 1:3000, anti-Emp24 poliklonál koelhu nian ho diluisaun 1:500, no anti-GFP poliklonál koelhu nian (prezente ida husi H. Riezman) ho diluisaun 1:3000. Antikorpu anti-Pgk1 monoklonál rate nian uza ho diluisaun 1:5000 (prezente ida husi J. de la Cruz). Antikorpu sekundáriu: Horseradish peroxidase (HRP) konjugadu bibi-malae anti-koelhu imunoglobulina G (IgG) ne'ebé uza ho diluisaun 1:3000 (Pierce). HRP-konjugadu goat anti-mouse IgG uza iha diluisaun 1:3000 (Pierce). Zona resposta imunidade nian hetan observasaun hosi métodu kimiluminesénsia hosi reajente SuperSignal West Pico (Thermo Fisher Scientific).
Hanesan deskreve iha (31), esperimentu imunopresipitasaun naturál ida hala'o iha frasaun ER ne'ebé riku. Ho liafuan badak, fase sélula fermentu sira ho tampón TNE [50 mM tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonil fluoride no mistura inibidor protease) iha 600 nm (OD600) iha densidade ótika 100 dala rua. Ida-ne'e rahun ho kontas vidru nian, no hafoin ne'e hasai tiha detritu sélula nian no kontas vidru nian liuhosi sentrifugasaun. Supernatante hafoin ne'e halo sentrifugasaun iha 17,000 g durante minutu 15 iha 4°C. Pellet ne'e suspende fali iha TNE no digitalis saponin aumenta ba konsentrasaun finál 1%. Suspensaun ne'e inkuba durante oras 1 ho rotasaun iha 4°C, no depois komponente sira ne'ebé labele rezolve hasai liuhosi sentrifugasaun iha 13,000 g iha 4°C durante minutu 60. Ba imunopresipitasaun Gas1-GFP, uluknanai pre-inkuba amostra ho kontas agarose mamuk (ChromoTek) iha 4°C durante oras 1, no hafoin inkuba ho GFP-Trap_A (ChromoTek) iha 4°C durante oras 3. Kontas imunopresipitadu sira fase dala lima ho TNE ne'ebé kontein 0.2% digoxigenin, elui ho tampón amostra SDS, haketak iha SDS-PAGE, no analiza liuhosi imunoblotting.
Hanesan deskreve iha (31), determinasaun ligasaun kruzada hala'o iha frasaun ER ne'ebé enrikese. Ho badak, frasaun ER ne'ebé enrikesidu inkuba ho 0.5 mM dithiobis (succinimidyl propionate) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, EUA; 20°C, 20 min). Reasaun ligasaun kruzada nian hamate liuhosi aumenta glisina (konsentrasaun finál 50 mM, minutu 5, 20°C).
Hanesan deskreve ona antes (50), análize MS ba ceramide iha estirpe selvajen no GhLag1 hala'o ona. Ho liafuan badak, sélula sira kuda to'o faze esponensiál (3 to'o 4 unidade OD600/ml) iha YPD iha 30°C, no sélula 25×107 maka kolleita. Sira nia metabolismo hamate ho ásidu trikloroasétiku. Uza solvente estrasaun [etanol, bee, éter, piridina no 4.2 N amóniu hidróxidu (15:15:5:1:0.018 v/v)] no 1.2 nmol husi padraun internu C17 ceramide (860517, Avanti polar lipid) kualidade). Uza reajente monometilamina [metanol, bee, n-butanol no solusaun metilamina (4:3:1:5 v/v)] hodi hala'o hidrolize alkalina kmaan ba extratu, no depois uza n-butanol saturadu ho bee hodi hasai masin. Ikus liu, extratu ne'e suspende fali iha solvente modo pozitivu [kloroformu/metanol/bee (2:7:1) + 5 mM asetadu amóniu] no injeta ba espektrómetru massa. Monitorizasaun multi-reasaun (MRM) hala'o ona ba identifikasaun no kuantifikasaun ba molékula esfingolípidu sira. Espektrómetru massa quadrupole tersiáriu TSQ Vantage (Thermo Fisher Scientific) ekipadu ho fonte ion nanoflow robótiku Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) ba análize lípidu. Enerjia kolizaun nian maka optimizadu ba kategoria seramida ida-idak. Dadus MS hetan iha modo pozitivu. Ba replikadu biolójiku ida-idak, sinál lípidu maka mediana hosi sasukat independente tolu.
Hanesan deskreve iha (31), sélula sira (800×107) ne'ebé espresa Gas1-GFP hetan imunopresipitasaun naturál. Gas1-GFP ne'ebé purifika ona haketak liuhosi SDS-PAGE no transfere ba membrana polivinilidenu fluoride (PVDF). Proteina ne'e vizualiza liuhosi kolorasaun PVDF ho amida metan. Banda Gas1-GFP tesi hosi PVDF no fase dala 5 ho metanol no dala ida ho bee ho grau kromatografia líkidu-MS (LC-MS). Hodi inkuba tira membrana nian ho 500μl 0.3 M NaOAc (pH 4.0), tampón no 500μl mistura nitritu sódiu 1 M ne'ebé foin disolve iha 37°C durante oras 3, frasaun lípidu nian sai hosi Gas1-GFP no Libertasaun infosofamina nian entre seramina no seramina (51). Hafoin ne'e, tira membrana nian fase dala haat ho bee ho grau LC-MS, maran iha temperatura ambiente, no rai iha atmosfera nitrojéniu iha -80°C to'o análize. Hanesan kontrolu, amostra mamuk ida hosi membrana PVDF uza ba esperimentu ida-idak. Lípidu ne'ebé hasai hosi Gas1-GFP hafoin ne'e analiza hosi MS hanesan deskreve ona (50). Ho liafuan badak, tira PVDF ne'ebé kontein GPI-lipid hetan resuspende iha 75μl solvente molde negativu [kloroformu/metanol (1:2) + 5 mM asetadu amóniu] no liu ionizasaun eletrospray (ESI)-MRM/MS Analysis of sphingolipid species (TSQ Vantage). Iha kazu ida-ne'e, dadus MS hetan iha modo ion negativu.
Hanesan temi ona antes, porsaun lípidu husi âncora GPI nian haketak husi [3H]-inositol-labeled GPI-AP (16). Lípidu sira haketak liuhosi kromatografia ho kamada mihis uza sistema solvente (55:45:10 chloroform-methanol-0.25% KCl) no vizualiza uza FLA-7000 (Fujifilm).
Sélula sira ne'ebé espresa Gas1-GFP (600×107) fase dala rua ho tampón TNE ho tampón TNE, no rahun ho kontas vidru nian, no hafoin halo sentrifugasaun hodi hasai detritu sélula nian no kontas vidru nian. Supernatante hafoin ne'e halo sentrifugasaun iha 17,000 g durante oras 1 iha 4°C. Pellet ne'e fase iha TNE no inkuba ho 1 U PI-PLC (Invitrogen) iha TNE ne'ebé kontein 0.2% digitalis saponin durante oras 1 iha 37°C. Hafoin tratamentu enzima, membrana hasai liuhosi sentrifugasaun iha 17,000 g iha 4°C durante oras 1. Atu imunopresipita Gas1-GFP, supernatante inkuba ho GFP-Trap_A (ChromoTek) iha 4°C durante kalan tomak. Gas1-GFP ne'ebé purifika ona ne'ebé haketak hosi SDS-PAGE hetan kór ho azul brillante Coomassie. Banda kolorasaun Gas1-GFP tesi tiha hosi kinur ne'ebé hale'u akueduktu, no hafoin alkilasaun ho iodoasetamida no redusaun ho ditiotreitol, hala'o dijestaun iha-jel ho tripsina. Hasai no maran péptidu tríptiku sira no péptidu sira ho GPI-glikanu sira. Peptide maran ne'e disolve iha bee 20 μl. Injeta porsaun ida (8μl) iha LC. Koluna octadecylsilane (ODS) (Develosil 300ODS-HG-5; diámetru interiór 150 mm×1.0 mm; Nomura Chemical, Aichi Prefecture, Japaun) uza hodi haketak peptide sira iha kondisaun gradiente espesífiku. Faze móvel maka solvente A (0.08% ásidu fórmiku) no solvente B (0.15% ásidu fórmiku iha 80% asetonitrilu). Sistema Accela HPLC (Thermo Fisher Scientific, Boston, Massachusetts) uza hodi elui koluna ho solvente A iha minutu 55 nia laran ho taxa fluxu 50 μl min-1 durante minutu 5, no depois konsentrasaun solvente B aumenta ba 40%. , Estadus Unidus). Eluadu ne'e introdús beibeik iha fonte ion ESI, no peptide tríptiku sira no peptide sira ho GPI-glycans analiza hosi LTQ Orbitrap XL (espektrómetru massa trap-orbitrap ion lineár híbridu; Thermo Fisher Scientific). Iha konfigurasaun MS, tensaun hosi fonte kapilár nian tau ba 4.5 kV, no temperatura hosi kapilár transferénsia nian mantein iha 300°C. Tensaun kapilar no tensaun lente tubu nian tau ba 15 V no 50 V, respetivamente. Dadus MS hetan iha modo ion pozitivu (rezolusaun 60,000; ezatidaun massa parte 10 kada millaun) iha luan massa 300/m/z rásiu massa/karga (m/z) 3000. Dadus MS/MS hetan liuhosi armadilha ion iha Orbit LTQ [XL] ne'ebé depende uluk ba dadus díjitu sira dissosiasaun induzidu hosi kolizaun (CID)].
Simulasaun MD sira hala'o uza software GROMACS (52) no kampu forsa MARTINI 2 (53-55). CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) hafoin ne'e uza hodi konstrui bilayer ida ne'ebé kontein dioleoylphosphatidylcholine (DOPC) no Cer C18 ka DOPC no Cer C26. Topolojia no koordenasaun sira husi Cer C26 mai husi DXCE hodi hasai kontas estra sira husi esfingosina nia ikun. Uza prosesu ne'ebé deskreve iha kraik atu halo balansu ba kamada duplu no hala'o, hafoin uza koordenasaun ikus sira sistema nian hodi harii sistema ida ne'ebé kontein Emp24. Domíniu transmembrana husi fermentu Emp24 (rezíduu 173 to'o 193) konstrui hanesan α-hélice uza estrutura molekulár ferramenta vizuál MD (VMD) (58). Depois, hafoin hasai tiha lípidu sira ne'ebé maka taka malu, proteína ne'e hetan granulasaun grosu no hatama iha bilayer uza CHARMM GUI. Sistema finál kontein 1202 DOPC no 302 Cer C26 ka 1197 DOPC no 295 Cer C18 no Emp24. Ioniza sistema ho konsentrasaun 0.150M. Replikadu independente haat maka halo ba kompozisaun bilayer rua.
Lipid bilayer hetan balansu uza prosesu CHARMM GUI, ne'ebé envolve minimiza no depois halo balansu ba etapa 405,000, iha ne'ebé limitasaun pozisaun nian redús no elimina gradualmente, no etapa tempu aumenta hosi 0.005 ps ba 0.02 ps. Hafoin ekilibrasaun, ida-ne'e produz 6 μs ho pasu tempu 0.02 ps. Depois de hatama Emp24, uza prosesu CHARMM GUI hanesan hodi minimiza no halo balansu ba sistema, no depois hala'o durante 8 s iha produsaun.
Ba sistema hotu-hotu, durante prosesu balansu, presaun kontrola hosi barostatu Berendsen (59), no durante prosesu produsaun, presaun kontrola hosi barostatu Parrinello-Rahman (60). Iha kazu hotu-hotu, presaun média maka 1 bar no uza eskema akoplamentu presaun semi-izotrópiku. Iha prosesu balansu no produsaun, termostatu (61) ho rekalibrasaun velosidade uza hodi akopla temperatura proteína, lípidu no partikula solvente respetivamente. Durante operasaun tomak, temperatura alvu maka 310K. Interasaun la-ligasaun nian kalkula liuhosi hamosu lista par ida uza eskema Verlet ho toleránsia buffer 0.005. Termu Coulomb nian kalkula uza kampu reasaun no distánsia tesi nian 1.1 nm. Termu Vander Waals uza eskema tesi nian ho distánsia tesi nian 1.1 nm, no eskema tesi Verlet nian uza ba deriva potensiál (62).
Uza VMD, komprimentu onda tetu entre kontas fosfatu DOPC ka kontas seramida AM1 no proteína maka 0.7 nm, no númeru lípidu sira ne'ebé interasaun ho proteína kalkula. Tuir fórmula tuirmai, kalkula fatór deplesaun-enrikesimentu (DE) hanesan iha (63): Fatór DE = (kuantidade lípidu totál iha proteína 0.7) iha proteína 0.7 (kuantidade Cer iha lípidu totál)
Valór ne'ebé maka relata hetan hanesan média, no barra erru sira maka kópia independente haat hosi SE. Signifikánsia estatístika husi fatór DE kalkula husi teste t [(averageDE-factor-1)/SE]. Kalkula valór P husi distribuisaun one-tailed.
Instrumentu GROMACS uza hodi kalkula mapa densidade laterál 2D hosi sistema ne'ebé kontein Emp24 iha 250 ns ikus hosi trasu. Atu hetan mapa enrikesimentu/esgotamentu seramida nian, mapa densidade Cer nian fahe ba soma mapa Cer no DOPC nian, no hafoin fahe ba konsentrasaun Cer nian iha isin. Uza eskala mapa kór ne'ebé hanesan.
Ba materiál suplementár sira ba artigu ida-ne'e, favór haree http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
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Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Serero, Logazhope (Serho), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
Imajen 3D ho rezolusaun aas iha tempu-reál revela importánsia hosi komprimentu kadeia seramida nian ba klasifikasaun proteína nian iha fatin saída seletivu sira.
Sofia Rodriguez-Gallardo, Kazuo Kurokawa, Susana Sabido-Bozo, Alejandro Cortez · Gomez (Alejandro Cortes-Gomez), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valeria Zoni (Valeria Zoni), Auxiliadora Aguilera-Romero, Ana Maria Perez -Lingio Serero, Logazhope (Serho), (Miho Waga), Misako Arman (Misako Arman), Miyako Riman (Miyako Riman), Prow Akira, Stefano Fanny, Akihiko Nakano, Manuel Muniz
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©2020 Asosiasaun Amerikana ba Avansu Siénsia nian. direitu hotu-hotu rezervadu. AAAS hanesan parseiru husi HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef no COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.