Prezente *Enderesu atuál: Cologne 50931, Alemaña, Cologne Excellence Cluster Peskiza kona-ba Resposta ba Estrese Selulár iha Moras sira ne'ebé relasiona ho Envelhesimentu (CECAD).
Neurodejenerasaun moras mitokondria nian konsidera hanesan irreversível tanba plastisidade metabóliku neuron sira nian limitadu, maibé efeitu hosi disfunsaun mitokondria nian iha autonomia sélula nian hosi metabolismo neuronál iha isin-lolon ladún komprende. Iha ne'e, ami introdús proteoma espesífiku ba sélula hosi neuron Purkinje ho defisiénsia OXPHOS progresiva ne'ebé kauza hosi dinámika fuzaun mitokondria ne'ebé perturba. Ami hetan katak disfunsaun mitokondria hamosu mudansa profundu iha kampu proteómika nian, ikusmai lori ba ativasaun sekuensiál hosi programa metabóliku sira ne'ebé loos molok mate sélula nian. La espera, ami determina indusaun klaru hosi piruvatu karboksilase (PCx) no peroxidase sira seluk relasiona ho suplementasaun intermédiu sira siklu TCA nian. Inibisaun PCx nian agrava estrese oxidativu no neurodejenerasaun, ne'ebé indika katak ateroskleroze iha efeitu protesaun iha neuron sira ne'ebé laiha OXPHOS. Restaurasaun husi fuzaun mitokondria iha neurona sira ne'ebé dezenvolve ona iha finál inverte kompletamente karakterístika metabóliku sira-ne'e, nune'e prevene mate sélula nian. Ami nia deskobrimentu sira identifika dalan sira ne'ebé uluk deskoñesidu ne'ebé fó reziliénsia ba disfunsaun mitokondria no hatudu katak neurodejenerasaun bele reverte maski iha faze ikus sira moras nian.
Papél sentrál mitokondria nian iha manutensaun metabolísmu enerjia neuronál nian hetan énfaze hosi sintoma neurolójiku sira ne'ebé luan ne'ebé asosiadu ho moras mitokondria ema nian. Moras sira-ne'e barak liu maka kauza hosi mutasaun jéniku sira ne'ebé regula espresaun jéniku mitokondria nian (1, 2) ka destruisaun jéniku nian ne'ebé relasiona ho dinámika mitokondria nian, ne'ebé indiretamente afeta estabilidade DNA mitokondria nian (mtDNA) (3, 4). Serbisu iha modelu animál sira hatudu katak hodi hatán ba disfunsaun mitokondria iha tesidu sira ne'ebé hale'u, dalan metabóliku konservadór sira (5-7) bele ativa, nune'e fornese hanoin importante sira kona-ba patojénesis moras kompleksu sira-ne'e nian. Iha kontraste maka'as, ita-nia komprensaun kona-ba mudansa metabóliku sira hosi tipu sélula espesífiku sira ne'ebé kauza hosi fallansu jerál hosi produsaun adenosina trifosfatu (ATP) mitokondria kakutak nian maka fundamentál (8), hodi subliña nesesidade atu identifika alvu terapéutiku sira ne'ebé bele uza hodi prevene ka prevene moras. Prevene neurodejenerasaun (9). Falta informasaun maka faktu katak sélula nervoza sira konsidera ho luan katak iha fleksibilidade metabóliku ne'ebé limitadu tebes kompara ho tipu sélula sira hosi tesidu sira ne'ebé hale'u (10). Tanba sélula sira-ne'e hala'o papél sentrál ida iha koordenasaun fornesimentu metabólitu sira ba neuron sira hodi promove transmisaun sináptika no hatán ba kondisaun sira kanek no moras nian, abilidade atu adapta metabolismo sélula nian ba kondisaun dezafiante sira hosi tesidu kakutak nian kuaze limitadu ba sélula gliál sira (11-14). Aleinde ne'e, heterojeneidade selulár inerente hosi tesidu kakutak nian difikulta tebes estudu hosi mudansa metabóliku sira ne'ebé akontese iha subgrupu neuronál espesífiku sira. Nu'udar rezultadu, uitoan de'it maka hatene kona-ba konsekuénsia selulár no metabóliku loloos hosi disfunsaun mitokondria iha neuron sira.
Atu bele komprende konsekuénsia metabóliku sira hosi disfunsaun mitokondria nian, ami izola neuron Purkinje (PNs) iha faze oioin hosi neurodejenerasaun ne'ebé kauza hosi destruisaun hosi fuzaun membrana esterna mitokondria nian (Mfn2). Maske mutasaun Mfn2 iha ema asosiadu ho forma ida hosi neuropatia sensoriál motora hereditária ne'ebé koñesidu hanesan Charcot-Marie-Tooth tipu 2A (15), destruisaun kondisionál hosi Mfn2 iha rate sira maka indusaun ida ne'ebé rekoñesidu ho di'ak hosi métodu disfunsaun fosforilasaun oxidasaun (OXPHOS). Subtipu neuronál oioin (16-19) no fenótipu neurodejenerativa ne'ebé rezulta akompaña ho sintoma neurolójiku progresivu sira, hanesan moras movimentu nian (18, 19) ka atáxia serebelár (16). Hodi uza kombinasaun ida hosi proteómika kuantitativu (LFQ) lahó rótulu, metabolómika, imajen, no métodu virolójiku sira, ami hatudu katak neurodejenerasaun progresiva induz maka'as piruvatu karboksilase (PCx) no fatór sira seluk ne'ebé envolve iha arterioskleroze hosi PN sira in vivo Espresaun hosi enzima sira. Atu verifika relevánsia husi deskobrimentu ida-ne'e, ami espesifikamente hamenus espresaun PCx iha PN sira ne'ebé defisiente Mfn2, no hetan katak operasaun ida-ne'e agrava estrese oxidativu no aselera neurodejenerasaun, nune'e prova katak azoospermia konfere mate sélula Adaptabilidade metabóliku. Espresaun maka'as husi MFN2 bele salva kompletamente dejenerasaun terminál PN ho defisiénsia OXPHOS maka'as, konsumu boot husi DNA mitokondria, no aparentemente rede mitokondria ne'ebé kotu, ne'ebé subliña liután katak forma neurodejenerasaun ida-ne'e bele rekupera iha faze avansadu moras nian molok mate sélula nian.
Atu bele vizualiza mitokondria iha Mfn2 knockout PNs, ami uza estirpe rate nian ne'ebé permite mitokondria dependente ba Cre atu alvu espresaun Cre proteina fluoresente mean (YFP) (mtYFP) (20) no verifika morfolojia mitokondria in vivo. Ami hetan katak destruisaun hosi jéniku Mfn2 iha PN sira sei lori ba divizaun graduál hosi rede mitokondria (Figura S1A), no mudansa dahuluk hetan iha semana 3 nia laran. Iha kontraste, dejenerasaun substansiál hosi kamada sélula PN nian, hanesan hatudu hosi lakon hosi imunokolorasaun Calbindin, la hahú to'o semana 12 nia laran (Figura 1, A no B). Tempu ne'ebé la hanesan entre mudansa sira uluk liu iha morfolojia mitokondria no inísiu vizivel hosi mate neuronál dudu ami atu investiga mudansa metabóliku sira ne'ebé hamosu hosi disfunsaun mitokondria molok mate sélula nian. Ami dezenvolve estratéjia ida bazeia ba klasifikasaun sélula ativadu ho fluoressénsia (FACS) hodi izola PN ne'ebé espresa YFP (YFP+) (Figura 1C), no iha rate kontrolu (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), ne'ebé tuirmai refere hanesan CTRL (Figura S1BRL). Optimizasaun ba estratéjia gating nian bazeia ba intensidade relativu hosi sinál YFP nian permite ita atu purifika isin YFP+ (YFPhigh) hosi PN sira hosi la'ós-PN sira (YFPneg) (Figura S1B) ka fragmentu axon/dendrítiku fluoresente putativu sira (YFPlow; Figura S1D, karuk), konfirmadu hosi mikroskópiu konfokal (Figura S1D, loos). Atu verifika identidade hosi populasaun ne'ebé klasifikadu, ami hala'o proteómika LFQ no hafoin análize komponente prinsipál, no hetan katak iha separasaun klaru entre sélula YFPhigh no YFPneg (Figura S1C). Sélula YFPhigh hatudu enrikesimentu líkidu ida hosi markadór PNs ne'ebé koñesidu (ezemplu, Calb1, Pcp2, Grid2 no Itpr3) (21, 22), maibé laiha enrikesimentu hosi proteína sira ne'ebé espresa baibain iha neuron sira ka tipu sélula sira seluk (Figura 1D) ). Komparasaun entre amostra sira iha sélula YFPhigh klasifikadu sira ne'ebé halibur iha esperimentu independente sira hatudu koefisiente korelasaun> 0.9, hatudu reprodutibilidade di'ak entre replikadu biolójiku sira (Figura S1E). Iha sumáriu, dadus sira-ne'e valida ami nia planu ba izolamentu agudu no espesífiku ba PN ne'ebé viável. Tanba sistema driver L7-cre ne'ebé uza induz rekombinasaun mosaiku iha semana dahuluk hafoin partu (23), ami hahú oho rate sira hosi CTRL no kondisionál (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Kolekta neuron sira. Hafoin rekombinasaun kompleta, ida-ne'e hanaran Mfn2cKO iha semana 4 nia laran. Hanesan pontu finál, ami hili semana 8 ho idade bainhira kamada PN sei intaktu nafatin maski iha fragmentu mitokondria ne'ebé klaru (Figura 1B no Figura S1A). Iha totál, ami kuantifika totál proteína 3013, ne'ebé besik 22% bazeia ba anotasaun MitoCarta 2.0 bazeia ba proteoma mitokondria hanesan mitokondria (Figura 1E) (Figura 1E) (24). Análize espresaun jéniku diferensiál ne'ebé hala'o iha semana 8 hatudu katak 10.5% de'it hosi proteína hotu-hotu iha mudansa signifikativu (Figura 1F no Figura S1F), ne'ebé proteína 195 hetan regulasaun tun no proteína 120 hetan regulasaun aas (Figura 1F). Importante atu nota katak "análize dalan inovativu" hosi konjuntu dadus ida-ne'e hatudu katak jéniku sira ne'ebé espresa ho diferensiál liuliu pertense ba konjuntu restritu ida hosi dalan metabóliku espesífiku sira (Figura 1G). Interesante, maski regulasaun tun hosi dalan sira ne'ebé relasiona ho OXPHOS no sinál kalsiu nian konfirma indusaun hosi disfunsaun mitokondria iha PN sira ne'ebé defisiente iha fuzaun, kategoria sira seluk ne'ebé envolve liuliu metabolismo amino asidu nian hetan regulasaun signifikativa, ne'ebé iha liña ho metabolismo ne'ebé akontese iha PN mitokondria nian. Rewiring maka konsistente. disfunsaun.
(A) Fotografia konfokál reprezentativu sira hosi seksaun serebelar sira hosi rate CTRL no Mfn2cKO ne'ebé hatudu lakon progresivu hosi PN sira (calbindin, kinur); núkleu sira hetan kontra-kolor ho DAPI. (B) Kuantifikasaun husi (A) (análize ida-de'it husi variasaun, ***P<0.001; n = 4 to'o 6 sírkulu husi rate tolu). (C) Fluxu serbisu esperimentál. (D) Distribuisaun mapa manas nian hosi markadór espesífiku sira ba Purkinje (leten) no tipu sélula sira seluk (klaran). (E) Diagrama Venn ne'ebé hatudu númeru proteína mitokondria nian ne'ebé identifika iha PN ne'ebé klasifikadu. (F) Gráfiku vulkaun nian hosi proteína sira ne'ebé espresa ho diferensiál iha neurona Mfn2cKO iha semana 8 (valór limite signifikasaun nian hosi 1.3). (G) Análize dalan kriatividade nian hatudu dalan lima ne'ebé importante liu ba regulasaun-sa'e (mean) no regulasaun-tun (azul) iha Mfn2cKO PN ne'ebé klasifika hanesan semana 8. Nivel espresaun médiu hosi proteína ida-idak ne'ebé detekta hatudu. Mapa manas ho eskala kinur: valór P ne'ebé ajusta ona. ns, la importante.
Dadus proteómiku hatudu katak espresaun proteína hosi kompleksu I, III, no IV tun neineik. Komplexu I, III, no IV hotu-hotu kontein subunidade esensiál sira ne'ebé kode ho mtDNA, enkuantu kompleksu II, ne'ebé kode de'it ho nukleár, bazikamente la afetadu (Figura 2A no Figura S2A). . Konsistente ho rezultadu proteómiku sira, imunohistokímika hosi seksaun sira tesidu serebelár nian hatudu katak nível subunidade MTCO1 (subunidade sitokroma C oxidase mitokondria 1) hosi kompleksu IV iha PN tun gradualmente (Figura 2B). Subunidade Mtatp8 ne'ebé kode ho mtDNA hetan redusaun signifikativa (Figura S2A), enkuantu nivel estadu estasionáriu hosi subunidade ATP sintase ne'ebé kode ho nukleár la muda, ne'ebé konsistente ho kompleksu F1 sub-montajen ATP sintase ne'ebé estável ne'ebé koñesidu bainhira espresaun mtDNA estavel. Formasaun ne'e konsistente. Interompe (7). Avaliasaun ba nivel mtDNA iha Mfn2cKO PNs ne'ebé klasifikadu liuhosi reasaun kadeia polimerase iha tempu-reál (qPCR) konfirma diminuisaun graduál iha númeru kópia mtDNA. Kompara ho grupu kontrolu, iha semana 8 nia laran, besik 20% de'it hosi nível mtDNA maka mantein (Figura 2C). Konsistente ho rezultadu sira-ne'e, kolorasaun mikroskopia konfokál husi Mfn2cKO PNs hodi detekta DNA hatudu konsumu dependente ba tempu husi nukleotida mitokondria (Figura 2D). Ami hetan katak kandidatu balun de'it ne'ebé envolve iha degradasaun proteína mitokondria no resposta ba estrese maka hetan regulasaun aas, inklui Lonp1, Afg3l2 no Clpx, no fatór sira montajen kompleksu OXPHOS nian. Laiha mudansa signifikativa iha nível proteína sira ne'ebé envolve iha apoptoze ne'ebé detekta (Figura S2B). Nune'e mós, ami hetan katak kanál mitokondria no retíkulu endoplasmátiku ne'ebé envolve iha transporte kalsiu iha de'it mudansa ki'ik sira (Figura S2C). Aleinde ne'e, avaliasaun ba proteína sira ne'ebé relasiona ho autofajia la hetan mudansa signifikativa sira, ne'ebé konsistente ho indusaun vizivel hosi autofagosoma sira ne'ebé observa iha vivo liuhosi imunohistokímika no mikroskopia eletróniku (Figura S3). Maibé, disfunsaun OXPHOS ne'ebé progresivu iha PN sira akompaña ho mudansa mitokondria ultraestruturál ne'ebé klaru. Agrupamentu mitokondria sira bele haree iha korpu sélula sira no ai-hun dendrítiku sira hosi Mfn2cKO PNs ho idade semana 5 no 8, no estrutura membrana interiór hetan ona mudansa profundu sira (Figura S4, A no B). Konsistente ho mudansa ultraestruturál sira-ne'e no diminuisaun signifikativa iha mtDNA, análize ba fatia serebelár aguda ho éster metil tetrametilrodamina (TMRM) hatudu katak potensiál membrana mitokondria iha Mfn2cKO PNs diminui signifikativamente (Figura S4C).
(A) Análize kursu tempu nian hosi nivel espresaun hosi kompleksu OXPHOS. Konsidera de'it proteína sira ho P<0.05 iha semana 8 (ANOVA rua). Liña pontuadu: Laiha ajustamentu kompara ho CTRL. (B) Karuk: Ezemplu ida hosi seksaun serebelár ne'ebé marka ho antikorpu anti-MTCO1 (barra eskala, 20 μm). Área ne'ebé okupa hosi korpu sélula Purkinje nian taka ho kór mean. Loos: Kuantifikasaun ba nível MTCO1 (análize ida-de'it ba variasaun; n = 7 to'o 20 sélula ne'ebé analiza hosi rate tolu). (C) análize qPCR hosi númeru kópia mtDNA iha PN ne'ebé klasifikadu (análize ida-de'it hosi variasaun; n = 3 to'o 7 rate). (D) Karuk: Ezemplu ida husi fatia serebelár ne'ebé marka ho antikorpu anti-ADN (barra eskala, 20 μm). Área ne'ebé okupa hosi korpu sélula Purkinje nian taka ho kór mean. Loos: Kuantifikasaun ba lezaun sira mtDNA nian (análize ida de'it ba variasaun; n = 5 to'o 9 sélula sira hosi rate tolu). (E) Ezemplu ida hosi seksaun serebelár aguda ne'ebé hatudu mitoYFP + sélula Purkinje (seta) iha gravasaun ida hosi klamp patch sélula tomak nian. (F) Kuantifikasaun husi kurva IV. (G) Rejistu reprezentativu sira hosi injesaun korrente depolarizante iha sélula CTRL no Mfn2cKO Purkinje. Trasu leten: Pulsa dahuluk ne'ebé maka hamosu AP. Trasu kraik: Frekuénsia AP másimu. (H) Kuantifikasaun husi input espontáneu pós-sináptiku (sPSPs). Trasu gravasaun reprezentativu no nia rasio zoom hatudu iha (I). Análize ida de'it hosi variasaun analiza n = 5 to'o 20 sélula hosi rate tolu. Dadus sira espresa hanesan média±SEM; *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (J) Vestuáriu reprezentativu sira hosi AP espontáneu ne'ebé rejista uza modo perfuradu patch clamp. Trasu leten: Frekuénsia AP másimu. Trasu kraik: zoom husi AP ida de'it. (K) Kuantifika frekuénsia média no másimu AP tuir (J). Teste Mann-Whitney; n = 5 sélula sira maka analiza hosi rate haat. Dadus sira espresa hanesan média±SEM; la importante.
Estragus OXPHOS ne'ebé klaru hetan iha Mfn2cKO PN ho idade semana 8, ne'ebé indika katak funsaun fiziolójiku neuron sira nian la normál tebes. Tanba ne'e, ami analiza karakterístika elétriku pasivu sira hosi neuron sira ne'ebé defisiente iha OXPHOS iha semana 4 to'o 5 no semana 7 to'o 8 liuhosi hala'o gravasaun sira hosi patch clamp sélula tomak nian iha fatia serebelár aguda sira (Figura 2E). La espera, médiu potensiál membrana deskansa no rezisténsia input husi neuron Mfn2cKO hanesan ho kontrolu, maski iha diferensa sutil entre sélula sira (Tabela 1). Nune'e mós, iha semana 4 to'o 5 nia laran, la hetan mudansa signifikativa iha relasaun korrente-tensaun (kurva IV) (Figura 2F). Maibé, laiha neurona Mfn2cKO ho idade semana 7 to'o 8 maka sobrevive ba rejime IV (etapa hiperpolarizasaun), ne'ebé indika katak iha sensibilidade klaru ba potensiál hiperpolarizasaun iha faze tarde ida-ne'e. Iha kontraste, iha neuron Mfn2cKO, korente depolarizadór sira ne'ebé kauza descarga potensiál asaun repetitiva (AP) nian hetan tolerasaun di'ak, ne'ebé indika katak sira nia padraun descarga jerál la signifikativamente diferente hosi neuron kontrolu semana 8 nian (Tabela 1 no Figura 2G). Nune'e mós, frekuénsia no amplitude hosi korrente pós-sináptiku espontáneu (sPSCs) komparavel ho sira hosi grupu kontrolu, no frekuénsia hosi eventu sira aumenta hosi semana 4 ba semana 5 ba semana 7 ba semana 8 ho aumentu ne'ebé hanesan (Figura 2, H no I). Períodu maturasaun sináptika iha PN sira (25). Rezultadu sira ne'ebé hanesan hetan hafoin halo PNs ne'ebé perfuradu. Konfigurasaun ida-ne'e prevene posivel kompensasaun ba defeitu sira ATP selulár nian, hanesan bele akontese iha gravasaun patch clamp selulár tomak nian. Liuliu, potensiál membrana deskansa nian no frekuénsia tiru espontáneu hosi neurona Mfn2cKO la afetadu (Figura 2, J no K). Iha sumáriu, rezultadu sira-ne'e indika katak PN sira ho disfunsaun OXPHOS ne'ebé klaru bele hasoru padraun sira descarga ho frekuénsia aas ho di'ak, indika katak iha mekanizmu kompensasaun ida ne'ebé permite sira atu mantein resposta eletrofiziolójiku sira ne'ebé besik normál.
Dadus sira espresa hanesan média ± SEM (análize ida de'it ba variasaun, teste komparasaun múltiplu Holm-Sidak nian; *P<0.05). Númeru unidade nian indika iha parénteze.
Ami hahú investiga se kategoria ruma iha konjuntu dadus proteómiku (Figura 1G) inklui dalan sira ne'ebé bele kontra defisiénsia OXPHOS ne'ebé maka'as, nune'e esplika tansá maka PN ne'ebé afetadu bele mantein eletrofisiolojia besik normál (Figura 2, E to'o K). . Análize proteómika hatudu katak enzima sira ne'ebé envolve iha katabolizmu aminoásidu sira ho kadeia ramu (BCAA) hetan regulasaun signifikativa (Figura 3A no Figura S5A), no produtu finál asetil-CoA (CoA) ka suksinil CoA bele suplementa trikarboksilatu sira iha siklu Ásidu arterioskleroze (TCA). Ami hetan katak konteúdu BCAA transaminase 1 (BCAT1) no BCAT2 rua ne'e aumenta. Sira kataliza etapa dahuluk hosi katabolizmu BCAA nian hodi hamosu glutamate hosi α-ketoglutarate (26). Subunidade hotu-hotu ne'ebé maka halo parte iha kompleksu keto asidu dehidrogenase (BCKD) ho kadeia ramu hetan regulasaun aas (komplexu ne'e kataliza dekarboksilasaun tuirmai no irreversível hosi eskeletu karbonu BCAA ne'ebé rezulta) (Figura 3A no Figura S5A). Maibé, laiha mudansa klaru iha BCAA rasik ne'ebé hetan iha PN ne'ebé klasifikadu, ne'ebé bele tanba aumentu iha absorsaun selulár hosi aminoásidu esensiál sira-ne'e ka uza fonte sira seluk (glikosia ka ásidu látiku) hodi suplementa siklu TCA (Figura S5B). PN sira ne'ebé laiha OXPHOS mós hatudu aumentu dekompozisaun glutamina no atividade transaminasaun iha semana 8 nia laran, ne'ebé bele reflete hosi regulasaun aas hosi enzima mitokondria glutaminase (GLS) no glutamina pyruvate transaminase 2 (GPT2) (Figura 3, A no C). Importante atu nota katak regulasaun aas GLS nian limitadu ba isoforma glutaminase C (GLS-GAC) (mudansa Mfn2cKO/CTRL nian maka maizumenus dala 4.5, P = 0.05), no nia regulasaun aas espesífiku iha tesidu kankru nian Bele suporta bioenerjia mitokondria nian. (27).
(A) Mapa manas nian hatudu mudansa iha nível proteína nian ba dalan espesífiku iha semana 8 nia laran. (B) Ezemplu husi fatia serebelár ne'ebé marka ho antikorpu anti-PCx (barra eskala, 20 μm). Seta mean hatudu ba isin sélula Purkinje nian. (C) Análize espresaun proteína nian iha tempu ne'ebé identifika hanesan kandidatu importante ba ateroskleroze (teste t múltiplu, *FDR <5%; n = rate 3-5). (D) Iha leten: Diagrama eskemátiku ida ne'ebé hatudu maneira oioin atu hatama karbonu markadu ne'ebé kontein iha [1-13C]trasadór piruvatu (ezemplu, liuhosi PDH ka dalan trans-arteriál). Iha kraik: Gráfiku violinu nian hatudu persentajen hosi karbonu ho marka ida de'it (M1) ne'ebé konverte ba ásidu aspártiku, ásidu sítriku no ásidu máliku hafoin tau marka ba fatia serebelar aguda sira ho [1-13C]piruvatu (teste t par; ** P <0.01). (E) Análize istória tempu nian ne'ebé komprensivu hosi dalan ne'ebé indika ona. Konsidera de'it proteína sira ho P<0.05 iha semana 8. Liña traseadu: laiha valór ajustamentu (análize variasaun rua-dalan; * P <0.05; *** P <0.001). Dadus sira espresa hanesan média±SEM.
Iha ami nia análize, katabolizmu BCAA sai hanesan dalan xave ida ba regulasaun aas. Faktu ida-ne'e sujere maka'as katak volume ventilasaun ne'ebé tama iha siklu TCA bele muda iha PN ne'ebé laiha OXPHOS. Ida-ne'e bele reprezenta forma prinsipál ida hosi rewiring metabóliku neuronál, ne'ebé bele iha impaktu diretu ba fiziolojia no sobrevivénsia neuronál durante manutensaun hosi disfunsaun OXPHOS ne'ebé maka'as. Konsistente ho hipóteze ida-ne'e, ami hetan katak enzima anti-aterosklerótika prinsipál PCx hetan regulasaun aas (Mfn2cKO/CTRL muda maizumenus dala 1.5; Figura 3A), ne'ebé kataliza konversaun piruvatu ba oxaloasetadu (28), ne'ebé fiar katak iha espresaun tesidu kakutak nian hetan restrisaun ba astrosis (29, 30). Konsistente ho rezultadu proteómiku sira, mikroskopia konfokál hatudu katak espresaun PCx aumenta espesífikamente no signifikativamente iha PN sira ne'ebé defisiente OXPHOS, enkuantu reatividade PCx restritu liuliu ba sélula gliál Bergmann adjasente sira hosi kontrolu (Figura 3B). Atu koko funsionalmente regulasaun aas ne'ebé observa ona husi PCx, ami trata fatia serebelár aguda ho [1-13C]trasador piruvatu. Bainhira piruvatu hetan oxidasaun hosi piruvatu dehidrogenase (PDH), nia rótulu isótopu lakon, maibé inkorpora iha intermédiu sira siklu TCA nian bainhira piruvatu hetan metabolizasaun hosi reasaun vaskulár sira (Figura 3D). Hodi apoia ami nia dadus proteómiku, ami observa númeru boot ida hosi markadór sira hosi trasador ida-ne'e iha ásidu aspártiku hosi fatia Mfn2cKO, enkuantu ásidu sítriku no ásidu máliku mós iha tendénsia moderadu, maski la signifikativu (Figura 3D).
Iha neuron dopamina sira hosi rate MitoPark ho disfunsaun mitokondria ne'ebé kauza hosi neuron dopamina sira ne'ebé espesifikamente estraga jéniku fatór transkrisaun mitokondria A (Tfam) (Figura S6B), espresaun PCx mós hetan regulasaun signifikativa (31), ne'ebé indika katak arterioskleroze ásidu asetona Okorrénsia hosi moras ne'e regula durante disfunsaun neuronál sira OXPHOS iha isin. Importante atu nota katak hetan ona katak enzima úniku sira (32-34) ne'ebé bele espresa iha neuron sira ne'ebé bele asosiadu ho arterioskleroze maka signifikativamente reguladu iha PN sira ne'ebé laiha OXPHOS, hanesan propionyl-CoA carboxylase (PCC-A), Malonyl-CoA konverte propionyl-CoA mitocolyl-CoA no succical mitocolylcondrial enzima 3 (ME3), ne'ebé nia papél prinsipál maka atu rekupera piruvatu husi malate (Figura 3, A no C) (33, 35). Aleinde ne'e, ami hetan aumentu signifikativu iha enzima Pdk3, ne'ebé fosforila no nune'e inativa PDH (36), enkuantu laiha mudansa sira ne'ebé detekta iha enzima Pdp1 ne'ebé ativa PDH ka kompleksu enzima PDH rasik (Figura 3A). Ho konsistente, iha Mern2cKO PNs, fosforilasaun husi subunidade α1 α (PDHE1α) husi komponente pyruvate dehydrogenase E1 husi kompleksu PDH iha Ser293 (koñesidu atu inibi atividade enzima husi PDH) aumenta (Figura S6C) (Figura S6C). Piruvatu laiha asesu ba vaskulár.
Ikus liu, ami hetan katak super dalan hosi biosinteze serina no glisina, siklu folate mitokondria (1C) relasionadu no biosinteze prolina (Figura 1G no Figura S5C) hotu-hotu hetan regulasaun signifikativa, tuir relatóriu sira, durante prosesu ativasaun. Tesidu sira ne'ebé hale'u ativa ho disfunsaun mitokondria (5-7). Análize konfokál ne'ebé suporta dadus proteómiku sira-ne'e hatudu katak iha PN ho OXPHOS ne'ebé laiha, fatia serebelár sira hosi rate sira ho idade semana 8 hetan sujeitu ba serina hidroximetiltransferase 2 (SHMT2), enzima xave ida hosi siklu folate mitokondria nian. Resposta imunidade ne'ebé signifikativu (Figura S5D). Iha 13 fatia serebelár aguda ne'ebé inkuba ho glikosia CU, esperimentu sira trasamentu metabóliku nian konfirma liután regulasaun aas hosi biosinteze serina no prolina, ne'ebé indika katak fluxu hosi isoforma karbonu nian ba serina no prolina aumenta (Figura S5E). Tanba reasaun sira ne'ebé promove hosi GLS no GPT2 maka responsavel ba sínteze glutamatu hosi glutamina no transaminasaun entre glutamatu no α-ketoglutaratu, sira nia regulasaun aas indika katak neuron sira ne'ebé defisiente iha OXPHOS iha aumentu ezijénsia ba glutamatu, Ida-ne'e bele ho objetivu atu mantein aumentu biosinteze hosi prolina (Figura S5). Iha kontraste ho mudansa sira-ne'e, análize proteómiku ida hosi astrositus serebelár sira hosi rate Mfn2cKO espesífiku PN nian hatudu katak dalan sira-ne'e (inklui antiperoxidase hotu-hotu) la muda signifikativamente iha espresaun, nune'e hatudu Rediresaun metabóliku ida-ne'e seletivu ba PN ne'ebé degradadu (Fig. S6, D to'o G).
Iha sumáriu, análize sira-ne'e hatudu padraun sira ne'ebé diferente tebes hosi ativasaun temporál hosi dalan metabóliku espesífiku sira iha PN sira. Maske funsaun mitokondria neuronál ne'ebé la normál bele hamosu ateroskleroze inisiál no remodelasaun 1C (Figura 3E no Figura S5C), no mós mudansa previzível sira iha espresaun kompleksu I no IV nian, mudansa sira iha sínteze serina de novo maka de'it sai aparente iha faze ikus sira. Disfunsaun OXPHOS (Figura 3E no Figura S5C). Deskobrimentu sira-ne'e define prosesu sekuensiál ida iha ne'ebé resposta mitokondria (siklu 1C) no sitoplazmátiku (biosinteze serina) ne'ebé induzidu hosi estrese ho sinérjiku ho aumentu iha ateroskleroze iha siklu TCA hodi forma fali metabolismo neuronál.
PNs ho defisiénsia OXPHOS ho idade semana 8 bele mantein atividade eksitasaun ho frekuénsia aas no hetan rekoneksaun metabóliku signifikativu hodi kompensa disfunsaun mitokondria. Deskoberta ida-ne'e hamosu posibilidade interesante ida katak maski iha momentu ida-ne'e, sélula sira-ne'e bele mós simu intervensaun terapéutiku hodi atraza ka prevene neurodejenerasaun. Tarde. Ami rezolve posibilidade ida-ne'e liuhosi intervensaun independente rua. Iha métodu dahuluk, ami dezeña vetor virus asosiadu ho adeno (AAV) ne'ebé dependente ba Cre atu nune'e MFN2 bele espresa ho seletivu iha PN sira ne'ebé defisiente iha OXPHOS in vivo (Figura S7A). AAV ne'ebé kode MFN2 no jéniku repórter fluoresente mCherry (Mfn2-AAV) verifika ona iha kultura neuron primáriu sira in vitro, ne'ebé kauza MFN2 atu espresa iha maneira dependente ba Cre no salva morfolojia mitokondria, nune'e prevene neuromutasaun iha neuron Mfn2cKO (Figura S7, D no B). Tuir mai, ami hala'o esperimentu in vivo hodi entrega estereotátikamente Mfn2-AAV ho idade semana 8 ba korteks serebelár Mfn2cKO no rate kontrolu nian, no analiza rate ho idade semana 12 (Figura 4A). Rate Mfn2cKO ne'ebé hetan tratamentu mate (Figura 1, A no B) (16). Transdusaun viral in vivo rezulta iha espresaun seletivu PN nian iha sírkulu serebelár balu (Figura S7, G no H). Injesaun husi AAV kontrolu ne'ebé espresa de'it mCherry (Ctrl-AAV) laiha efeitu signifikativu ba grau neurodejenerasaun iha animál Mfn2cKO. Iha kontraste, análize husi Mfn2cKOs ne'ebé transduz ho Mfn2-AAV hatudu efeitu protesaun signifikativu husi kamada sélula PN (Figura 4, B no C). Liuliu, densidade neuron parese kuaze labele distinge hosi animál kontrolu sira (Figura 4, B no C, no Figura S7, H no I). Espresaun MFN1 maibé la'ós MFN2 hanesan efetivu hodi salva mate neuronál (Figura 4C no Figura S7, C no F), ne'ebé indika katak espresaun MFN1 ektópiku bele suplementa ho efetivu falta MFN2. Análize liután iha nivel PN úniku hatudu katak Mfn2-AAV salva barak liu ultraestrutura mitokondria nian, normaliza nível mtDNA nian, no inverte espresaun aas hosi markadór anti-anjiojéneze PCx (Figura 4, C to'o E ). Inspesaun vizuál ba rate Mfn2cKO ne'ebé salva iha estadu deskansa hatudu katak sira nia postura no sintoma motor (movimentu S1 to'o S3) hadi'a. Iha konkluzaun, esperimentu sira-ne'e hatudu katak reintrodusaun atrazadu hosi MFN2 iha PN sira ne'ebé defisiente maka'as iha OXPHOS sufisiente atu reverte konsumu mtDNA no induz ateroskleroze, nune'e prevene dezenvolvimentu axón no mate neuronál in vivo.
(A) Eskema ida ne'ebé hatudu oráriu esperimentál ba injesaun AAV ne'ebé kode MFN2 bainhira dalan metabóliku ne'ebé indika ativa. (B) Fotografia konfokál reprezentativu sira hosi seksaun serebelár ho idade semana 12 ne'ebé transduz ho rate Mfn2cKO iha semana 8 no marka ho antikorpu anti-Calbindin. Loos: Eskalasaun ba fibra axon sira. Eskala hosi zoom axon nian maka 450 no 75 μm. (C) Karuk: Kuantifikasaun ba densidade sélula Purkinje iha loop transdusaun AAV (AAV+) (análize ida-de'it ba variasaun; n = 3 rate). Loos: análize foku mtDNA iha PN transduzidu iha semana 12 (teste t la par; n = sélula 6 hosi rate tolu). * P <0.05; ** P <0.01. (D) Mikrografia eletróniku transmisaun reprezentativu husi PNs husi seksaun serebelar Mfn2cKO ne'ebé transduz ho vetor viral sira ne'ebé indika. Máskara kór-roza ilustra área ne'ebé okupa hosi dendrita sira, no kuadradu ho pontu mean ilustra zoom ne'ebé fornese iha liman-loos; n reprezenta núkleu. Barra eskala nian, 1μm. (E) hatudu ezemplu ida husi kolorasaun PCx iha PN ne'ebé transduz iha semana 12 nia laran. Barra eskala nian, 20μm. OE, espresaun liu; FC, mudansa dobrada.
Ikus liu, ami investiga importánsia hosi sobrevivénsia sélula induzidu hosi peroxidase iha PN sira ne'ebé maka esperiénsia ona disfunsaun OXPHOS. Ami hamosu mCherry ne'ebé kode AAV-shRNA (RNA badak) ne'ebé espesifikamente alvu ba mRNA PCx rate nian (AAV-shPCx), no injeta vírus ka nia kontrolu ne'ebé kahur (AAV-scr) iha serebelum rate Mfn2cKO nian. Injesaun hala'o iha semana dahaat idade nian (Figura 5A) hodi atinji knockdown PCx ne'ebé efetivu durante períodu ne'ebé espresaun PCx aumenta (Figura 3C) no kamada sélula PN nian sei intaktu hela (Figura 1A). Importante atu nota katak hamonu PCx (Figura S8A) lori ba aselerasaun signifikativa ida ba mate PN nian, ne'ebé maka hanesan úniku anel infesaun nian ne'ebé restritu (Figura 5, B no C). Atu bele komprende mekanizmu hosi efeitu metabóliku sira ne'ebé induzidu hosi regulasaun aas PCx nian, ami estuda estatutu redox hosi PN sira hafoin PCx knockdown no biosensor óptiku mediadu hosi AAV Grx1-roGFP2 espresa simultaneamente (Figura S8, B to'o D) hodi avalia glutationa Mudansa relativu hosi potensiál peptide redox (383). Hafoin, ami hala'o mikroskopia imajen fluoressénsia foton rua (FLIM) iha fatia kakutak aguda husi Mfn2cKO semana 7 ka littermates kontrolu hodi detekta mudansa potensiál iha estatutu redox sitoplazmátiku hafoin verifika kondisaun FLIM (Figura S8, E to'o G). Análize hatudu aumentu signifikativu iha estadu oxidasaun husi Mfn2cKO PNs ida de'it ne'ebé laiha espresaun PCx, ne'ebé diferente husi neuron kontrolu ka Mfn2cKO PNs ne'ebé espresa de'it shRNA ne'ebé kahur (Figura 5, D no E). Bainhira espresaun PCx hetan regulasaun tun, persentajen husi Mfn2cKO PNs ne'ebé hatudu estadu oxidadu maka'as aumenta liu dala tolu (Figura 5E), ne'ebé indika katak regulasaun PCx mantein kapasidade redox husi neuron sira ne'ebé dezenvolve ona.
(A) Eskema ida ne'ebé hatudu oráriu esperimentál ba injesaun AAV ne'ebé kode shPCx bainhira dalan metabóliku ne'ebé indika ativa. (B) Fotografia konfokál reprezentativu sira hosi seksaun serebelár ho idade semana 8 iha rate Mfn2cKO ne'ebé transduz no marka ho antikorpu anti-kalsineurina iha semana 4 nia laran. Barra eskala nian, 450μm. (C) Kuantifikasaun hosi densidade sélula Purkinje nian iha loop sira ne'ebé transduzidu hosi AAV (análize ida-de'it hosi variasaun; n = 3 to'o 4 rate). Dadus sira espresa hanesan média±SEM; ***P<0.001. (D) Imajen FLIM reprezentativu hatudu vida média husi PN ho idade semana 7 ne'ebé espresa sensor redox glutathione Grx1-roGFP2 iha kondisaun esperimentál ne'ebé espesifika ona. LUT (look-up table) ratio: intervalu tempu sobrevivénsia (iha pikosegundu). Barra eskala nian, 25μm. (E) Histograma hatudu distribuisaun hosi valór sira vida moris Grx1-roGFP2 nian hosi (D) (n=158 to'o 368 sélula iha rate rua iha kondisaun ida-idak). Gráfiku pie iha histograma ida-idak nia leten: hatudu númeru sélula sira ho valór durasaun vida ne'ebé signifikativamente naruk liu (mean, oxidadu) ka badak liu (azul, redús), ne'ebé liu 1 SD hosi valór vida média iha CTRL-AAV-scr. (F) Modelu ne'ebé propoin hatudu efeitu protesaun hosi regulasaun aas hosi PCx neuronál.
Hotu-hotu, dadus ne'ebé ami fornese iha ne'e hatudu katak re-espresaun MFN2 nian bele salva kompletamente PN avansadu ho defisiénsia OXPHOS grave, deplesaun mtDNA grave, no morfolojia hanesan ista ne'ebé la normál tebes, nune'e fornese progresu kontínuu maski iha moras avansadu sira. Neurodejenerasaun fornese evidénsia reversível hosi faze molok mate sélula nian. Grau fleksibilidade metabóliku ida-ne'e hetan énfaze liután hosi abilidade hosi neuron sira atu induz ateroskleroze (refiu ida hosi siklu TCA), ne'ebé inibi espresaun PCx iha PN sira ne'ebé laiha OXPHOS no hasa'e mate sélula nian, nune'e hala'o papél protesaun nian (Figura 5F).
Iha estudu ida-ne'e, ami fornese evidénsia katak resposta husi PN sira ba disfunsaun OXPHOS maka atu konverje neineik ba ateroskleroze siklu TCA liuhosi dalan ativasaun diferensiál ne'ebé ativa husi programa metabóliku sira. Ami konfirma análize proteómiku ho métodu komplementár barak no revela katak bainhira hetan dezafiu hosi disfunsaun mitokondria maka'as, neurona sira iha forma elastisidade metabóliku ne'ebé uluk deskoñesidu. Ami hakfodak, prosesu rewiring tomak la nesesariamente marka estadu metabóliku terminál ne'ebé akompaña neurodejenerasaun neineik no irreversivelmente, maibé ami nia dadus sujere katak ida-ne'e bele konstitui neuron manutensaun ida maski iha faze antes mate sélula nian Mekanizmu kompensasaun funsionál. Deskobrimentu ida-ne'e indika katak neuron sira iha grau konsideravel ida hosi plastisidade metabóliku iha isin. Faktu ida-ne'e prova katak reintrodusaun ikus liu hosi MFN2 bele reverte espresaun hosi markadór metabóliku xave sira no prevene dezenvolvimentu PN. Pelu kontráriu, ida-ne'e inibi ateroskleroze no aselera nervu sira. transseksuál.
Deskobrimentu ida ne'ebé maka furak liu iha ami nia peskiza maka PN sira ne'ebé laiha OXPHOS bele modifika metabolismo siklu TCA nian liuhosi regula enzima sira ne'ebé maka estimula espesifikamente arterioskleroze. Rearranju metabóliku maka karakterístika komún ida hosi sélula kankru nian, balun ne'ebé depende ba glutamina hodi suplementa intermédiu sira siklu TCA nian hodi produz ekivalente redutór sira, ne'ebé dudu kadeia respiratóriu no mantein produsaun hosi prekursór biosínteze lípidu no nukleotida nian (39 , 40). Estudu ida foin lalais ne'e hatudu katak iha tesidu perifériku sira ne'ebé esperiénsia disfunsaun OXPHOS, rekoneksaun metabolismo glutamina/glutamate nian mós hanesan karakterístika proeminente ida (5, 41), iha ne'ebé diresaun entrada glutamina nian iha siklu TCA depende ba Tanba gravidade lezaun OXPHOS nian (41). ). Maibé, laiha evidénsia klaru kona-ba kualkér semellansa hosi plastisidade metabóliku neuronál iha isin no ninia posivel relevánsia iha kontestu moras nian. Iha estudu in vitro ida foin lalais ne'e, hatudu katak neuron kortikal primáriu sira mobiliza grupu glutamatu ba neurotransmisaun, nune'e promove metabolismo oxidativu no ateroskleroze iha kondisaun estrese metabóliku (42). Importante atu nota katak iha inibisaun farmakolojia hosi enzima siklu TCA suksinatu dehidrogenase, karboksilasaun piruvatu fiar katak mantein sínteze hosi oxaloasetatu iha neurona gránula serebelár ne'ebé kuda (34). Maibé, relevánsia fiziolójika hosi mekanizmu sira-ne'e ba tesidu kakutak nian (iha ne'ebé ateroskleroze fiar katak limitadu liuliu ba astrosita sira) iha nafatin signifikasaun fiziolójika importante (43). Iha kazu ida-ne'e, ami nia dadus hatudu katak PN sira ne'ebé hetan estragu hosi OXPHOS iha isin bele muda ba degradasaun BCAA no karboksilasaun piruvatu, ne'ebé maka sai hanesan fonte prinsipál rua hosi suplementasaun hosi intermédiu sira pool TCA nian. Maske kontribuisaun putativa hosi katabolizmu BCAA ba metabolismo enerjia neuronál propoin ona, aleinde papél hosi glutamatu no GABA ba neurotransmisaun (44), seidauk iha evidénsia ba mekanizmu sira-ne'e in vivo. Tanba ne'e, fasil atu halo espekulasaun katak PN disfunsionál sira bele kompensa automatikamente ba konsumu intermédiu TCA nian ne'ebé maka dudu hosi prosesu asimilasaun hodi aumenta ateroskleroze. Liuliu, regulasaun aas PCx nian bele presiza atu mantein demanda ne'ebé aumenta ba ásidu aspártiku, ne'ebé hatudu ona iha sélula sira ne'ebé prolifera ho disfunsaun mitokondria (45). Maibé, ami nia análize metabolómika la revela mudansa signifikativa ruma iha nivel estadu-estavel hosi ásidu aspártiku iha Mfn2cKO PNs (Figura S6A), ne'ebé presumavelmente reflete utilizasaun metabóliku diferente hosi ásidu aspártiku entre sélula sira ne'ebé prolifera no neuron pós-mitótiku sira. Maske mekanizmu loloos hosi regulasaun PCx iha neuron disfunsionál sira in vivo sei presiza atu karakteriza, ami hatudu katak resposta prematura ida-ne'e iha papél importante ida hodi mantein estadu redox hosi neuron sira, ne'ebé hatudu iha esperimentu FLIM iha fatia serebelar sira. Liuliu, prevene PN sira hosi regula PCx bele hamosu estadu ida ne'ebé oxidadu liu no aselera mate sélula nian. Ativasaun degradasaun BCAA no karboksilasaun piruvatu la'ós dalan sira atu karakteriza tesidu perifériku sira disfunsaun mitokondria nian (7). Tanba ne'e, sira parese sai hanesan karakterístika prioridade ida hosi neuron sira ne'ebé defisiente iha OXPHOS, maski la'ós karakterístika úniku, ne'ebé importante ba neurodejenerasaun. .
Moras serebelar maka tipu moras neurodejenerativa ne'ebé heterojéneu ne'ebé normalmente manifesta hanesan ataxia no dala barak estraga PN sira (46). Populasaun neuron ida-ne'e partikularmente vulneravel ba disfunsaun mitokondria tanba sira nia dezenvolvimentu seletivu iha rate sira sufisiente atu reproduz sintoma motor barak ne'ebé karakteriza atáxia espinoserebelar ema nian (16, 47, 48). Tuir relatóriu sira, modelu rate transjéniku ida ho jéniku mutante ida asosiadu ho atáxia espinoserebelár umanu no iha disfunsaun mitokondria (49, 50), subliña importánsia atu estuda konsekuénsia sira hosi defisiénsia OXPHOS iha PNPH. Tanba ne'e, ida-ne'e partikularmente apropriadu atu izola no estuda ho efetivu populasaun neuron úniku ida-ne'e. Maibé, tanba PN sira sensivel tebes ba presaun no kontribui ba proporsaun ki'ik ida hosi populasaun sélula serebelár tomak, ba estudu barak bazeia ba omics, separasaun seletivu hosi sira hanesan sélula tomak sai nafatin aspetu ida ne'ebé dezafiante. Maski kuaze imposivel atu atinji falta absoluta hosi kontaminasaun hosi tipu sélula sira seluk (liuliu tesidu adultu sira), ami kombina etapa dissosiasaun ida ne'ebé efetivu ho FACS hodi hetan númeru ne'ebé sufisiente hosi neurona viável sira ba análize proteómika downstream, no iha kobertura proteína ne'ebé aas tebes (besik proteína 3000) kompara ho dadus ezistente hosi konjuntu serebelu tomak (15). Hodi prezerva viabilidade sélula tomak nian, métodu ne'ebé ami fornese iha ne'e permite ami la'ós de'it atu verifika mudansa sira iha dalan metabóliku sira iha mitokondria, maibé mós atu verifika mudansa sira iha ninia omólogu sitoplazmátiku sira, ne'ebé komplementa uza enrikesimentu rótulu membrana mitokondria nian ne'ebé espesífiku ba tipu sélula sira Métodu foun ba númeru kompleksu mitokondria nian iha tesidu mitokondria nian (255, 25). Métodu ne'ebé ami deskreve la'ós de'it relasiona ho estudu kona-ba sélula Purkinje, maibé bele aplika ho fasil ba tipu sélula ruma hodi rezolve mudansa metabóliku sira iha kakutak ne'ebé moras, inklui modelu sira seluk kona-ba disfunsaun mitokondria.
Ikus liu, ami identifika ona janela terapéutiku ida durante prosesu rearranju metabóliku ida-ne'e ne'ebé bele reverte kompletamente sinál xave sira hosi estrese selulár no prevene dezenvolvimentu neuronál. Tanba ne'e, komprende implikasaun funsionál sira hosi rewiring ne'ebé deskreve iha ne'e bele fornese hanoin fundamentál sira kona-ba tratamentu posivel sira hodi mantein viabilidade neuronál durante disfunsaun mitokondria. Peskiza iha futuru ne'ebé ho objetivu atu analiza mudansa sira iha metabolismo enerjia iha tipu sélula kakutak sira seluk presiza atu revela kompletamente aplikabilidade prinsípiu ida-ne'e nian ba moras neurolójiku sira seluk.
MitoPark nia rate sira deskreve ona antes (31). Rate C57BL/6N ho loxP ne'ebé hale'u jéniku Mfn2 deskreve ona antes (18) no kruza ho rate L7-Cre (23). Projéniu heterozigotu duplu ne'ebé rezulta hafoin ne'e kruza ho rate homozigotu Mfn2loxP/Mfn2loxP hodi hamosu knockout sira jéniku espesífiku Purkinje nian ba Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Iha subkonjuntu ida hosi kaben, alelu Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP (stop-mtYFP) introdús liuhosi kruzamentu adisionál sira (20). Prosedimentu animál hotu-hotu hala'o tuir matadalan europeu, nasionál no institusionál sira no hetan aprovasaun hosi LandesamtfürNatur hosi Umwelt no Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Alemaña. Serbisu ba animál sira mós tuir orientasaun hosi Federasaun Europeia hosi Asosiasaun sira Siénsia Animál Laboratóriu nian.
Hafoin halo anestesia ba feto isin-rua nia dislokasaun servikál, embriaun rate nian hetan izolamentu (E13). Korteza hetan dissesaun iha Solusaun Masin Ekilibradu Hanks nian (HBSS) ne'ebé suplementa ho Hepes 10 mM no pasa ba Dulbecco nia Médiu Modifikadu Eagle nian ne'ebé kontein papain (20 U/ml) no sisteína (1μg/ml). Inkuba tesidu iha DMEM) no disosia liuhosi dijestaun enzimátika. Ml) iha 37°C durante minutu 20, no hafoin ne'e molla mekanikamente iha DMEM ne'ebé suplementa ho 10% sérum bovinu feto nian. Sélula sira kuda iha vidru ne'ebé taka ho polilisina ho densidade 2×106 kada pratu kultura 6 cm ka ho densidade 0.5×105 sélula/cm2 ba análize imajen nian. Liutiha oras 4, meiu ne'e troka ho meiu ne'ebé laiha sérum Neurobasal ne'ebé kontein suplementu B27 1% no GlutaMax 0.5 mM. Hafoin ne'e, neuron sira mantein iha 37°C no 5% CO2 durante esperimentu tomak, no fó han semana ida dala ida. Atu induz rekombinasaun in vitro, 3μl (24-well culture dish) ka 0.5μl (24-well plate) hosi vetor virus AAV9 tuirmai uza hodi trata neuron sira iha loron daruak in vitro: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, númeru katálogu 105530-AAV9) no AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, númeru katálogu 105545-AAV9).
Rate Mfn1 no Mfn2 komplementár DNA (hetan hosi Addgene plasmid #23212 no #23213, respetivamente) marka ho sekuénsia V5 (GKPIPNPLLGLDST) iha C-terminus, no fuze ho mCherry iha kuadru liuhosi sekuénsia T2A. Grx1-roGFP2 maka prezente ida husi Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Hodi troka kasete tdTomato uza métodu klonasaun konvensionál, kasete ne'e hetan subklonasaun iha pAAV-CAG-FLEX-tdTomato nia kotuk-laran (númeru referénsia Addgene 28306) hodi hamosu pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-G FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 no pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vetor sira. Estratéjia hanesan uza hodi hamosu vetor kontrolu pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Atu bele hamosu konstrusaun AAV-shPCx, presiza vetor plasmidu AAV (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), ne'ebé kontein sekuénsia DNA ne'ebé kode shRNA ne'ebé alvu ba rate PCx (5′CTTTCGCTAGCTAGGCTAAGGCTAAGGCTAGACTAGGACTTAGA 3′) Iha kontrolu husi promotór U6, mCherry uza iha kontrolu husi promotór CMV. Produsaun ba vetor AAV auxiliar sira hala'o tuir instrusaun sira fabrikante nian (Cell Biolabs). Ho liafuan badak, uza plasmidu transferénsia ida ne'ebé lori mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) Transfesaun tranziente husi sélula 29A-MFN2-V5-AV5-MFN2-V5, mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) ka Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kode jenu, no mós kode AAV1 proteina kapsida no proteina asesória Plasmide embalajen, uza métodu kalsiu fosfatu. Supernatante vírus brutu hetan liuhosi siklu sira konjelamentu-deskongelamentu nian iha jelu maran/etanol no sélula sira ne'ebé liza iha fosfatu tampón salina (PBS). Vetor AAV hetan purifikasaun liuhosi ultrasentrifugasaun gradiente iodixanol diskontínua (oras 24 iha 32,000 rpm no 4°C) no konsentra uza filtru sentrifuga Amicon ultra-15. Títulu jenoma nian husi AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2.9×1013 kópia jenoma (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6.1×1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX hanesan deskreve uluk ona (45), sasukat kuantitativu husi PCR (PCR) -MFN1-V5 (1.9×1013 GC/ml) no AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8.9×1012 GC/ml).
Neuron primáriu sira hasai iha PBS 1x ne'ebé malirin hanesan jelu, halo pelet, no hafoin ne'e omojeniza iha 0.5% Triton X-100 / 0.5% desoxikolatu sódiu/tampón lisi PBS ne'ebé kontein fosfatase no inibidor protease (Roche). Kuantifikasaun proteína nian hala'o liuhosi uza ensaiu bicinchoninic acid (Thermo Fisher Scientific). Proteina sira hafoin ne'e haketak liuhosi eletroforeze gel SDS-poliakrilamida, no hafoin ne'e halo blot ba membrana polivinilidenu fluoride (GE Healthcare). Blokeia fatin sira ne'ebé la espesífiku no inkuba ho antikorpu primáriu (haree Tabela S1 ba detalle sira) iha susubeen 5% iha TBST (Tris-buffered saline ho Tween), etapa sira fase nian no antikorpu sekundáriu iha TBST Inkuba. Inkuba ho antikorpu primáriu durante kalan ida iha +4°C. Hafoin fase, aplika antikorpu sekundáriu durante oras 2 iha temperatura ambiente. Tuir mai, hodi inkuba blot hanesan ho antikorpu anti-β-actin, karregamentu hanesan hetan konfirmasaun. Deteksaun liuhosi konversaun ba kimiluminesénsia no hasa'e kimiluminesénsia (GE Healthcare).
Neuron sira ne'ebé uluk kuda iha vidru nia taka-fatin sira fiksa ho 4% paraformaldeídu (PFA)/PBS iha pontu tempu espesífiku iha temperatura ambiente durante minutu 10. Coverslips sira uluknanai permea ho 0.1% Triton X-100/PBS durante minutu 5 iha temperatura ambiente, no depois iha tampón blokeiu [3% bovine serum albumin (BSA)/PBS]. Iha loron daruak, coverslips sira fase ho tampón blokeiu no inkuba ho antikorpu sekundáriu konjugadu ho fluoróforu apropriadu durante oras 2 iha temperatura ambiente; ikus liu, amostra sira fase didi'ak iha PBS ho 4′,6-diamidino-2 -Phenylindole (DAPI) ne'ebé maka kontra-kolora no hafoin ne'e fiksa iha slide mikroskópiu ho Aqua-Poly/Mount.
Rate sira (mane no feto) hetan anestesia liuhosi injesaun intraperitoneál ketamina (130 mg/kg) no xylazine (10 mg/kg) no administra subkutáneamente ho analjéziku carprofen (5 mg/kg), no tau iha instrumentu estereotátiku (Kopf) ne'ebé ekipadu ho pakote manas. Hatudu kakutak no uza broka dentál ida hodi halo mihis parte hosi korteks serebelár ne'ebé koresponde ba ruin mis (husi lambda: ikun 1.8, laterál 1, koresponde ba lóbulu IV no V). Uza agulha seringa ne'ebé kurvadu hodi kria ho kuidadu kuak ki'ik ida iha kakutak hodi evita perturba vaskulatura iha kraik. Hafoin ne'e, kapilár vidru ne'ebé mihis hatama neineik ba iha mikro-kuak (husi -1.3 to'o -1 iha parte ventrál dura mater nian), no 200 to'o 300 nl AAV injeta ba iha mikro-injetór (Narishige) ho seringa manuál (Narishige) dala barak ho presaun ki'ik iha períodu tempu minutu 20 to'o janela. Hafoin infuzaun, tau kapilár ba minutu 10 tan atu permite virus ne'e atu hada'et kompletamente. Hafoin kapilár sira hasai tiha, kulit ne'e sutura ho kuidadu atu minimiza inflamasaun kanek nian no permite animál atu rekupera. Animál sira hetan tratamentu ho analjéziku (caspofen) durante loron balun hafoin operasaun, durante tempu ne'ebé sira nia kondisaun fíziku hetan monitorizasaun ho kuidadu no depois sira hetan eutanasia iha pontu tempu ne'ebé maka hateten ona. Prosedimentu hotu-hotu hala'o tuir matadalan europeu, nasionál no institusionál sira no hetan aprovasaun hosi LandesamtfürNatur hosi Umwelt no Verbraucherschutz, North Rhine-Westphalia, Alemaña.
Animál sira hetan anestesia ho ketamina (100 mg/kg) no xilazina (10 mg/kg), no fuan hetan perfuzaun ho 0.1 M PBS uluk, no depois ho 4% PFA iha PBS. Tesidu ne'e hetan dissesaun no fiksa iha 4% PFA/PBS durante kalan ida iha 4°C. Fatuk vibrasaun ida (Leica Microsystems GmbH, Vienna, Austria) uza hodi prepara seksaun sagitál sira (50 μm mahar) hosi kakutak ne'ebé metin iha PBS. Eseptu espesifikasaun seluk, kolorasaun ba seksaun sira ne'ebé namlele livre hala'o hanesan deskreve iha leten (13) iha temperatura ambiente no agitasaun. Ho liafuan badak, dahuluk, fatia sira ne'ebé hetan hetan permeabilizasaun ho 0.5% Triton X-100/PBS durante minutu 15 iha temperatura ambiente; ba epítopu balu (Pcx no Shmt2), liuhosi tampón tris-EDTA iha 80°C (PH 9) manas fatia sira durante minutu 25 envezde etapa ida-ne'e. Tuir mai, seksaun sira inkuba ho antikorpu primáriu (haree Tabela S1) iha tampón blokeiu (3% BSA/PBS) iha 4°C durante kalan tomak ho agitasaun. Iha loron tuirmai, seksaun sira fase ho tampón blokeiu no inkuba ho antikorpu sekundáriu konjugadu ho fluoróforu apropriadu durante oras 2 iha temperatura ambiente; ikus liu, seksaun sira fase didi'ak iha PBS, kontra-ko'a ho DAPI, no hafoin fiksa ho AquaPolymount Iha slide mikroskópiu ida.
Mikroskópiu konfokál ho eskaneamentu laser (TCS SP8-X ka TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) ne'ebé ekipadu ho laser naroman mutin no laser ultravioleta 405 diode uza hodi halo imajen ba amostra. Hodi emosiona fluoróforu no halibur sinál ho Detetór Híbridu (HyDs), software LAS-X uza hodi halibur imajen sira ne'ebé empilhadu ne'ebé konforme ho amostrajen Nyquist iha modo sekuensiál: ba painél sira ne'ebé la'ós kuantitativu, maka sinál sira ne'ebé dinámiku tebes (ezemplu, iha sélula somátika no dendrita sira) MtYFP DY FPD hodi detekta númeru Hybrid iha direita BRRs modo). Gating husi 0.3 to'o 6 ns maka aplika atu hamenus background.
Imajen iha tempu-reál hosi sélula sira ne'ebé klasifikadu. Hafoin halo klasifikasaun iha meiu Neurobasal-A ne'ebé kontein suplementu B27 1% no GlutaMax 0.5 mM, sélula sira kuda kedas iha vidru ne'ebé taka ho poli-l-lisina (μ-Slide8 Well, Ibidi, númeru katálgu 80826), no depois rai iha 37°C no CO durante oras ida hodi husik sélula rezolve. Imajen iha tempu-reál hala'o iha mikroskópiu konfokál eskaneamentu laser Leica SP8 ne'ebé ekipadu ho laser mutin, HyD, lente objetivu mina-rai 63×[1.4 abertura numérika (NA)] no palku manas nian.
Rate ne'e hetan anestesia lalais ho dióksidu karbonu no dekapitadu, kakutak hasai lalais hosi kabun-been, no tesi ba iha parte sajital ho mahar 200μm (ba esperimentu 13C) ka mahar 275μm (ba esperimentu foton rua) ne'ebé nakonu ho materiál sira tuirmai ne'e. Walldorf, Alemaña) nakonu ho substánsia sira tuirmai: 125 mM jelu-malirin, saturadu ho karbonu (95% O2 no 5% CO2) Ca2 ki'ik + líkidu serebroespinál artifisiál (ACSF) NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampón fosfatu sódiu, NaCl 2.5 mM, 2.5 mM CO2 0.5 mM CaCl2 no 3.5 mM MgCl2 (presaun osmótika 310 to'o 330 mmol). Transfere fatia sira kakutak nian ne'ebé hetan ba iha kámara pré-inkubasaun ne'ebé kontein Ca2 + ACSF aas liu (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampón fosfatu sódiu, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 10 mM Ca. MgCl2) Médiu) pH 7.4 no 310 to'o 320 mmol).
Durante prosesu imajen nian, fatia sira muda ba sala imajen dedikadu ida, no esperimentu hala'o iha perfuzaun ACSF kontínua ho temperatura konstante 32° to'o 33°C. Mikroskópiu eskaneamentu laser multifoton (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) ne'ebé ekipadu ho lente objetivu Leica 25x (NA 0.95, bee), laser Ti: Sapphire (Chameleon Vision II, Coherent) uza ba imajen fatia. Módulu FLIM (PicoHarp300, PicoQuant).
FLIM husi Grx1-roGFP2. Mudansa sira iha estadu redox sitoplazmátiku PN sira nian sukat hosi FLIM ho foton rua iha fatia kakutak sagital, iha ne'ebé biosensor Grx1-roGFP2 alvu PN sira. Iha kamada PN, kampu akizisaun nian hili besik 50 to'o 80 μm iha superfísie fatia nia okos hodi asegura katak iha PN ne'ebé viável (katak, falta estrutura kontas ka mudansa morfolójiku neuronál sira tuir dendrita sira) no sensor roGFP2 pozitivu duplu no AAV ne'ebé kode shRNA PCx ka nia sekuénsia kontrolu (ko-espresaun mChery). Halibur imajen sira ho pilha ida de'it ho zoom dijitál 2x [komprimentu onda eksitasaun: 890 nm; 512 nm 512 pixels]. Deteksaun: HyD internu, grupu filtru fluorescein isothiocyanate (FITC)] no média imajen nian iha minutu 2 to'o 3 nia laran uza atu asegura katak foton sira ne'ebé sufisiente maka halibur (foton 1000 iha totál) ba ajustamentu kurva nian. Sensibilidade husi sonda Grx1-roGFP2 no verifikasaun husi kondisaun FLIM hala'o liu husi monitorizasaun ba valór durasaun moris husi roGFP2 bainhira aumenta H2O2 ezojéniu 10 mM ba perfuzaun ACSF (atu maximiza oxidasaun, hodi rezulta iha aumentu vida), no hafoin aumenta 2 mM dithiothreit (halo redusaun iha grau redusaun diminuisaun iha durasaun moris) (Figura S8, D to'o G). Uza software FLIMfit 5.1.1 hodi analiza rezultadu sira ne'ebé hetan, ajusta kurva decaimentu eksponensiál úniku hosi imajen tomak ba IRF ne'ebé sukat (funsaun resposta instrumentu), no χ2 maka maizumenus 1. Atu kalkula vida moris hosi PN ida de'it, máskara iha nervu nia isin dezeña manualmente, uza kuantifikasaun média ida ba kada máskara.
Análize potensiál mitokondria nian. Hafoin seksaun aguda inkuba ho 100 nM TMRM ne'ebé aumenta diretamente ba ACSF ne'ebé perfuza ona durante minutu 30, mudansa potensiál mitokondria PN sira nian sukat ho mikroskópiu ho foton rua. Imajen TMRM hala'o liuhosi exsita sonda iha 920 nm no uza HyD internu (tetrametilrodamina isotiosianatu: 585/40 nm) hodi halibur sinál sira; hodi uza komprimentu onda eksitasaun ne'ebé hanesan maibé uza HyD internu ne'ebé diferente (FITC :525/50) hodi imajen mtYFP. Uza ImageJ nia plug-in Kalkuladór Imajen nian hodi avalia potensiál mitokondria iha nivel sélula ida de'it. Ho liafuan badak, ekuasaun plug-in: sinál = min (mtYFP, TMRM) uza hodi identifika rejiaun mitokondria ne'ebé hatudu sinál TMRM iha Purkinje Somali iha imajen konfokál single-stack hosi kanál korrespondente. Depois área pixel iha máskara ne'ebé rezulta kuantifika, no depois normaliza iha imajen limiar korrespondente hosi kanál mtYFP hodi hetan frasaun mitokondria ne'ebé hatudu potensiál mitokondria.
Imajen ne'e dekonvoluta ho software Huygens Pro (Scientific Volume Imaging). Ba imajen sira ne'ebé eskaneadu hosi azuleju sira, montajen hosi azuleju ida de'it maka halo uza algoritmu kose automátiku ne'ebé fornese hosi software LAS-X. Hafoin kalibrasaun imajen, uza ImageJ no Adobe Photoshop hodi prosesa liután imajen no ajusta uniformemente nabilan no kontraste. Uza Adobe Illustrator ba preparasaun gráfiku.
análize foku mtDNA. Númeru lezaun mtDNA nian kuantifika iha seksaun serebelár sira ne'ebé marka ho antikorpu sira hasoru DNA liuhosi mikroskópiu konfokál. Área alvu ida-idak kria ba isin sélula no núkleu sélula ida-idak nian, no área respetiva kalkula uza plug-in Multi Measure (software ImageJ). Hasai área nukleár hosi área isin sélula nian hodi hetan área sitoplazmátika. Ikus liu, plug-in Analyze Particles (software ImageJ) uza hodi kuantifika automatikamente pontu DNA sitoplasmátiku ne'ebé indika mtDNA iha imajen limiar, no rezultadu sira ne'ebé hetan normaliza ba média PN husi rate CTRL. Rezultadu sira espresa hanesan númeru médiu nukleózidu sira nian kada sélula.
Análize espresaun proteína nian. Uza ImageJ nia plug-in Kalkuladór Imajen nian hodi avalia espresaun proteína iha PN iha nivel sélula ida de'it. Ho liafuan badak, iha imajen konfokal kamada ida de'it hosi kanál korrespondente, liuhosi ekuasaun: sinál = min (mtYFP, antikorpu), rejiaun mitokondria ne'ebé hatudu imunoreatividade ba antikorpu ida iha Purkina identifika. Depois área pixel iha máskara ne'ebé rezulta maka kuantifika, no depois normaliza iha imajen single-stack limiar korrespondente hosi kanál mtYFP hodi hetan frasaun mitokondria hosi proteína ne'ebé hatudu.
Análize densidade sélula Purkinje nian. Plug-in Cell Counter husi ImageJ uza hodi avalia densidade Purkinje nian hodi fahe númeru husi sélula Purkinje ne'ebé sura ho komprimentu husi anel serebelár ne'ebé okupa husi sélula sira ne'ebé sura.
Preparasaun no kolesaun amostra nian. Kakutak sira hosi grupu kontrolu no rate Mfn2cKO sira fiksa iha 2% PFA/2.5% glutaraldeídu iha 0.1 M tampón fosfatu (PB), no hafoin ne'e prepara seksaun koronál sira uza ciliates (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Austria) (Espessura 50 to'o 60) Tampón fiksa iha 1% PB tetraóxidu no 1.5% potássiu ferrosianida iha temperatura ambiente durante oras 1. Seksaun sira fase dala tolu ho bee destiladu, no hafoin ne'e kolora ho 70% etanol ne'ebé kontein 1% uranil asetadu durante minutu 20. Seksaun sira hafoin ne'e dezidrata iha alkol graduadu no enkaixa iha Durcupan ACM (Araldite casting resin M) epoxy resin (Electron Microscopy Sciences, númeru katálgu 14040) entre vidru sira ne'ebé taka ho silikon, no ikusmai iha 60°C Polimeriza iha fornu durante oras 48. Área korteks serebelár nian maka hili no tesi seksaun ultrafinu 50 nm iha Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vienna, Áustria) no hili iha grella fenda kobre 2×1 mm ne'ebé maka revestidu ho filme polistirenu. Seksaun sira hetan ko'a ho solusaun 4% uranil asetadu iha H2O durante minutu 10, fase ho H2O dala barak, hafoin ho Reynolds lead citrate iha H2O durante minutu 10, no hafoin fase ho H2O dala barak. Mikrografia sira hasai ho mikroskópiu eletróniku transmisaun Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) uza kámara dijitál TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 (TVIPS GmbH, Gauting, EUA). Alemaña).
Ba rate sira ne'ebé infetadu ho AAV, kakutak haketak no tesi ba iha seksaun sagitál ho mahar 1 mm, no ezamina serebelu uza mikroskópiu fluoressénsia hodi identifika anel ne'ebé infetadu ho AAV (katak, espresa mCherry). Uza de'it esperimentu sira iha ne'ebé injesaun AAV rezulta iha efisiénsia transdusaun ne'ebé aas tebes hosi kamada sélula Purkinje nian (katak kuaze kamada tomak) iha pelumenus anel serebelár rua tuituir malu. Loop ne'ebé transduzidu hosi AAV hetan mikrodisesaun ba pós-fiksasaun durante kalan (4% PFA no 2.5% glutaraldeídu iha 0.1 M cocoate buffer) no prosesa liután. Ba inkorporasaun EPON, tesidu ne'ebé metin fase ho 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem), no inkuba ho 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) iha 0.1 M sodium cocoate buffer (Applichem) Oras 4, hafoin fase durante oras 2. Halo filafali dala 3 ho tampón kokamida 0.1 M. Tuir mai, série asendente etanol nian uza hodi inkuba solusaun etanol ida-idak iha 4°C durante minutu 15 hodi dezidrata tesidu. Tesidu ne'e transfere ba óxidu propilenu no inkuba durante kalan ida iha EPON (Sigma-Aldrich) iha 4°C. Tau tesidu iha EPON foun iha temperatura ambiente durante oras 2, no hafoin tau iha 62°C durante oras 72. Uza ultramicrotome (Leica Microsystems, UC6) no katana diamante (Diatome, Biel, Switzerland) hodi tesi seksaun ultrafin 70 nm, no kolora ho 1.5% uranil asetadu durante minutu 15 iha 37°C, no kolora ho solusaun sitratu chumbo durante minutu 4. Mikrografia eletróniku sira hasai uza mikroskópiu eletróniku transmisaun JEM-2100 Plus (JEOL) ne'ebé ekipadu ho Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) no software DigitalMicrograph (Gatan). Ba análize, mikrografia eletróniku sira hetan ho zoom dijitál 5000× ka 10,000×.
Análize morfolójiku mitokondria nian. Ba análize hotu-hotu, kontur sira hosi mitokondria individuál sira trasa manualmente iha imajen dijitál sira uza software ImageJ. Parámetru morfolójiku oioin maka analiza. Densidade mitokondria espresa hanesan persentajen ne'ebé hetan liuhosi fahe área mitokondria totál hosi sélula ida-idak ho área sitoplasma (área sitoplasma = área sélula-área núkleu sélula) × 100. Redonda mitokondria nian kalkula ho fórmula [4π∙(área/perímetru 2)]. Morfolojia ista mitokondria nian analiza no fahe ba kategoria rua ("tubular" no "blister") tuir sira nia forma prinsipál.
Análize númeru no densidade autofagosoma/lisosoma. Uza software ImageJ hodi trasa manualmente kontur sira hosi autofagosoma/lisosoma ida-idak iha imajen dijitál. Área autofagosoma/lisosoma espresa hanesan persentajen ne'ebé kalkula liuhosi fahe área estrutura autofagosoma/lisosoma totál hosi sélula ida-idak ho área sitoplasma (área sitoplasma=área sélula-área núkleu)×100. Densidade autofagosoma/lisosoma nian kalkula liuhosi fahe númeru totál ho númeru estrutura autofagosoma/lisosoma nian kada sélula (iha termu área sitoplazmátika) (área sitoplazmátika = área sélula-área nukleár).
Rotulajen ba seksaun aguda no preparasaun amostra. Ba esperimentu sira ne'ebé presiza marka glikóze, transfere fatia sira kakutak nian ba iha kámara pré-inkubasaun nian, ne'ebé kontein karbonu saturadu (95% O2 no 5% CO2), Ca2 + ACSF aas (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM tampón fosfatu sódiu, 2.5 mM NaCl, 2.5 mM. d-glikosia, 1.0 mM CaCl 2 no 2.0 mM MgCl 2, ajusta ba pH 7.4 no 310 to'o 320 mOsm), iha ne'ebé glikosia maka 13 C 6- Substituisaun glikosia (Eurisotop, númeru katalogu CLM-1396). Ba esperimentu sira ne'ebé presiza marka piruvatu, transfere fatia sira kakutak nian ba Ca2 + ACSF ne'ebé aas liu (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 10 mM Ca.Cl no Ad. MgCl2, ajusta ba pH 7.4 no 310 ba 320mOsm), no aumenta 1mM 1-[1-13C]pyruvate (Eurisotop, númeru katálogu CLM-1082). Inkuba seksaun sira durante minutu 90 iha 37°C. Iha esperimentu nia rohan, seksaun sira fase lalais ho solusaun akuoza (pH 7.4) ne'ebé kontein 75 mM karbonatu amóniu, no hafoin ne'e omojeniza iha 40:40:20 (v:v:v) asetonitrilu (ACN): metanol: bee. Hafoin seksaun sira inkuba iha jelu durante minutu 30, amostra sira hetan sentrifugasaun iha 21,000 g durante minutu 10 iha 4°C, no supernatante ne'ebé moos maran iha konsentradór SpeedVac. Pellet metabólitu maran ne'ebé rezulta rai iha -80°C to'o análize.
Análize kromatografia líkidu-espektrometria massa nian hosi aminoásidu 13 ho marka C. Ba análize kromatografia líkidu-espektrometria massa (LC-MS), pelet metabólitu nian suspende fali iha 75μl bee ho grau LC-MS (Honeywell). Hafoin sentrifugasaun iha 21,000 g durante minutu 5 iha 4°C, 20 μl husi supernatante ne'ebé klarifikadu uza ba análize fluxu amino asidu, enkuantu restu husi extratu uza kedas ba análize anion (haree iha kraik). Análize amino asidu hala'o uza protokolu derivatizasaun kloridu benzoil ne'ebé deskreve ona antes (55, 56). Iha etapa dahuluk, 10μl husi 100 mM karbonatu sódiu (Sigma-Aldrich) aumenta ba 20μl husi extratu metabólitu, no depois 10μl husi 2% benzoyl chloride (Sigma-Aldrich) aumenta ba LC grau ACN. Amostra ne'e halo vortex ba tempu badak no depois halo sentrifugasaun iha 21,000 g durante minutu 5 iha 20°C. Transfere supernatante ne'ebé hamoos ona ba iha vial autosampler 2 ml ho insertu vidru kóniku (volume 200 μl). Amostra sira analiza uza sistema LC ho dezempeñu aas tebes Acquity iClass (Waters) ne'ebé liga ba espektrómetru massa presizaun ho rezolusaun aas Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) (Thermo Fisher Scientific). Ba análize, 2μl hosi amostra derivatizadu injeta ba iha koluna T3 sílika ho forsa aas 100×1.0 mm (Waters) ne'ebé kontein partikula 1.8μm. Taxa fluxu maka 100μl/min, no sistema tampón kompostu husi tampón A (10 mM formatu amóniu no 0.15% ásidu fórmiku iha bee) no tampón B (ACN). Gradiente maka hanesan tuirmai: 0%B iha minutu 0; 0%B. 0 to'o 15% B iha minutu 0 to'o 0.1; 15 to'o 17% B iha minutu 0.1 to'o 0.5; B iha 17 to'o 55% iha minutu 0.5 to'o 14; B iha 55 to'o 70% iha minutu 14 to'o 14.5; iha 14.5 to'o 70 to'o 100% B iha minutu 18; 100% B iha minutu 18 to'o 19; 100 to'o 0% B iha minutu 19 to'o 19.1; 0% B iha minutu 19.1 to'o 28 (55, 56). Espektrómetru massa QE-HF funsiona iha modo ionizasaun pozitivu ho luan massa m/z (rasio massa/karga) husi 50 to'o 750. Rezolusaun ne'ebé aplika maka 60,000, no alvu ion kontrolu ganhu (AGC) ne'ebé hetan maka 3×106, no tempu ion másimu maka 10 milisegundu. Fonte ionizasaun eletrospray manas (ESI) funsiona ho tensaun spray 3.5 kV, temperatura kapilar 250°C, fluxu ar bainha 60 AU (unidade arbitráriu), no fluxu ar auxiliar 20 AU. 250°C. Lente S nian tau iha 60 AU.
Análize kromatografia anion-MS husi ásidu orgániku sira ne'ebé marka ho 13C. Presipitadu metabólitu restu (55μl) analiza uza sistema kromatografia ion Dionex (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) ne'ebé liga ba espektrómetru massa QE-HF (Thermo Fisher Scientific). Ho liafuan badak, 5μl husi extratu metabólitu injekta ba iha koluna Dionex IonPac AS11-HC ne'ebé ekipadu ho HPLC (2 mm×250 mm, medida partikula 4μm, Thermo Fisher Scientific) iha modo loop parsiál push-in ho rásiu enxe 1. )on. Dionex IonPac AG11-HC guard column (2 mm x 50 mm, 4μm, Thermo Fisher Scientific). Temperatura koluna nian mantein iha 30°C, no autosampler tau iha 6°C. Uza kartuxa hidróxidu potássiu ne'ebé fornese ho bee deionizadu hodi hamosu gradiente hidróxidu potássiu liuhosi jeradór eluente. Separasaun hosi metabólitu sira ho taxa fluxu 380μl/min, aplika gradiente tuirmai: 0 to'o minutu 3, 10 mM KOH; 3 to'o 12 minutu, 10 to'o 50 mM KOH; 12 to'o 19 minutu, 50 to'o 100 mM KOH; 19 to'o 21 minutu, 100 mM KOH; 21 to'o 21.5 minutu, 100 to'o 10 mM KOH. Koluna ne'e hetan fali ekilibrasaun iha 10 mM KOH nia okos durante minutu 8.5.
Metabólitu sira ne'ebé elui ona kombina ho fluxu suplementu isopropanol 150μl/min hafoin koluna no hafoin ne'e diriji ba espektrómetru massa ho rezolusaun aas ne'ebé funsiona iha modo ionizasaun negativu. MS monitoriza hela luan massa nian husi m/z 50 to'o 750 ho rezolusaun 60,000. AGC maka 1×106, no tempu ion másimu maka 100 ms. Fonte ESI ne'ebé manas funsiona ho tensaun spray 3.5 kV. Konfigurasaun sira seluk hosi fonte ion nian maka hanesan tuirmai: temperatura kapilar 275°C; fluxu gás iha bainha, 60 AU; fluxu gás auxiliár, 20 AU iha 300°C, no konfigurasaun lente S ba 60 AU.
Análize dadus husi metabólitu sira ne'ebé marka ho 13C. Uza software TraceFinder (versaun 4.2, Thermo Fisher Scientific) ba análize dadus hosi proporsaun isótopu. Identidade husi kompostu ida-idak verifika ona husi kompostu referénsia ne'ebé konfiável no analiza independentemente. Atu hala'o análize enrikesimentu isótopu, área husi kromatograma ion ne'ebé hasai (XIC) husi kada isótopu 13C (Mn) hasai husi [M + H] +, iha ne'ebé n maka númeru karbonu husi kompostu alvu, uza hodi analiza amino asidu sira ka [ MH] + uza hodi analiza anion sira. Akurasi massa XIC nian menus husi parte lima kada millaun, no akurasi RT nian maka minutu 0.05. Análize enrikesimentu hala'o liuhosi kalkula rásiu hosi isótopu ida-idak ne'ebé detekta ba soma hosi isótopu hotu-hotu hosi kompostu ne'ebé korresponde. Rasio sira-ne'e fó hanesan valór persentajen ba isótopu ida-idak, no rezultadu sira espresa hanesan enrikesimentu persentajen molar (MPE), hanesan deskreve ona antes (42).
Pellet neuron ne'ebé konjeladu hetan omojeneizasaun iha metanol 80% (v/v) ne'ebé malirin hanesan jelu, halo vortex, no inkuba iha -20°C durante minutu 30. Vortex fali amostra no kahur iha +4°C durante minutu 30. Amostra ne'e sentrifuga iha 21,000 g durante minutu 5 iha 4°C, no depois supernatante ne'ebé rezulta rekolla no maran uza konsentradór SpeedVac iha 25°C ba análize tuirmai. Hanesan deskreve ona iha leten, análize LC-MS hala'o iha amino asidu sira hosi sélula sira ne'ebé maka klasifika ona. Uza TraceFinder (versaun 4.2, Thermo Fisher Scientific), análize dadus hala'o uza masa monoisótopu hosi kompostu ida-idak. Normalizasaun kuantil hosi dadus metabólitu nian hala'o uza pakote software preprocessCore (57).
Preparasaun fatia nian. Rate ne'e hetan anestesia lalais ho dióxidu karbonu no dekapitadu, kakutak hasai lalais hosi kakutak, no katana vibrasaun ne'ebé nakonu ho jelu (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Alemaña) uza hodi tesi nia ba seksaun sagitál 300 to'o 375 μm gasifikasaun karbonu no COd 29% O Ca2 + ACSF ki'ik (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 1.0 mM CaCl2 no 6.0 mM MgCl2 Ajusta ba pH 40 mM no 30 mO). Transfere fatia sira kakutak nian ne'ebé hetan ona ba iha kámara ida ne'ebé kontein Ca2 + ACSF aas liu (125.0 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.25 mM sodium phosphate buffer, 25.0 mM NaHCO3, 25.0 mM d-glucose, 4.0 mM CaCl mM no pH 5 MM 7.4 no 310 to'o 320 mOsm). Rai fatia sira durante minutu 20 to'o 30 atu nune'e bele restaura antes grava.
gravasaun. Palku mikroskópiu ida ne'ebé ekipadu ho kámara gravasaun ne'ebé metin no lente objetivu imersaun bee 20x (Scientifica) uza ba gravasaun hotu-hotu. Sélula Purkinje putativu sira identifika hosi (i) medida isin nian, (ii) lokalizasaun anatómiku hosi serebelu, no (iii) espresaun hosi jéniku repórter mtYFP fluoresente. Pipeta ho rezisténsia ponta 5 to'o 11 megohms hasai hosi kapilár vidru borosilikatu (GB150-10, 0.86 mm×1.5 mm×100 mm, Science Products, Hofheim, Alemaña) no pipeta horizontál Instruments (P-10000, Sutter, CA). Gravasaun hotu-hotu hala'o hosi ELC-03XS npi patch clamp amplifier (npi electronic GmbH, Tam, Germany), ne'ebé kontrola hosi software Signal (versaun 6.0, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Esperimentu ne'e rejista ho taxa amostrajen 12.5 kHz. Sinál ne'e filtra ho filtru Bessel rua ho frekuénsia tetu 1.3 no 10 kHz respetivamente. Kapasitánsia hosi membrana no pipeta hetan kompensasaun hosi sirkuitu kompensasaun nian ne'ebé uza amplifikadór. Esperimentu hotu-hotu hala'o iha kontrolu husi kámara Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu, Gerden, Alemaña), ne'ebé kontrola husi software Hokawo (versaun 2.8, Hamamatsu, Gerden, Alemaña).
Konfigurasaun no análize rutina ba sélula tomak. Molok atu grava, enxe pipeta ho solusaun internu ne'ebé kontein substánsia sira tuirmai: 4.0 mM KCl, 2.0 mM NaCl, 0.2 mM EGTA, 135.0 mM potassium gluconate, 10.0 mM Hepes, 4.0 mM ATP (M0 mM), 5 MM trifos. (GTP) (Na) no 10.0 mM kreatinina fosfatu ajusta ba pH 7.25, no presaun osmótika maka 290 mOsm (sukrose). Imediatamente hafoin aplika forsa 0 pA hodi sobu membrana, sukat potensiál membrana deskansa nian. Rezisténsia input nian sukat liuhosi aplika korrente hiperpolarizadu sira -40, -30, -20, no -10 pA. Sukat magnitude husi resposta tensaun nian no uza lei Ohm nian hodi kalkula rezisténsia input nian. Atividade espontáneu rejista iha pregu tensaun nian durante minutu 5, no sPSC identifika no sukat iha Igor Pro (versaun 32 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, EUA) uza skript rekoñesimentu semi-automátiku. Kurva IV no korrente estadu-estavel sukat liuhosi prega bateria iha potensiál oioin (hahú hosi -110 mV) no aumenta tensaun iha etapa 5 mV. Produsaun AP nian koko liuhosi aplikasaun korrente depolarizante ida. Prega sélula iha -70 mV enkuantu aplika pulsa korrente depolarizadór. Ajusta medida pasu nian husi unidade gravasaun ida-idak ketak-ketak (10 to'o 60 pA). Kalkula frekuénsia AP másimu liuhosi sura manualmente pulsa sira ne'ebé kauza frekuénsia AP aas liu. Limite AP nian analiza liuhosi uza derivadu daruak hosi pulsa depolarizasaun nian ne'ebé maka hamosu uluk AP ida ka liu.
Konfigurasaun no análize ba fatin perfuradu. Halo gravasaun ba patch perfuradu uza protokolu padraun sira. Uza pipeta ida ne'ebé laiha ATP no GTP ne'ebé la kontein ingrediente sira tuirmai: 128 mM gluconate K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0.1 mM EGTA no 2 mM MgCl2, no ajusta ba pH 7.2 (uza KOH). ATP no GTP la tama iha solusaun intraselulár hodi prevene permeabilidade la kontroladu hosi membrana sélula nian. Pipeta patch nian nakonu ho solusaun internu ne'ebé kontein anfoterisina (maizumenus 200 to'o 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich) hodi hetan rejistu ida kona-ba patch perfuradu. Anfoterisina disolve iha dimethyl sulfoxide (konsentrasaun finál: 0.1 to'o 0.3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Konsentrasaun DMSO ne'ebé uza laiha efeitu signifikativu ba neuron sira ne'ebé estuda. Durante prosesu perfurasaun, rezisténsia kanál (Ra) hetan monitorizasaun beibeik, no esperimentu hahú hafoin amplitude Ra no AP estabiliza (minutu 20-40). Atividade espontánea sukat iha tensaun no/ka korrente nia pregu durante minutu 2 to'o 5. Análize dadus hala'o uza Igor Pro (versaun 7.05.2, WaveMetrics, EUA), Excel (versaun 2010, Microsoft Corporation, Redmond, EUA) no GraphPad Prism (versaun 8.1.2, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Estadus Unidus). Atu identifika AP espontáneu sira, uza plug-in NeuroMatic v3.0c IgorPro nian. Identifika automatikamente AP sira uza limite ida ne'ebé maka fó, ne'ebé maka ajusta individualmente ba rejistu ida-idak. Uza intervalu spike, determina frekuénsia spike ho frekuénsia spike instantaneu másimu no frekuénsia spike médiu.
Izolamentu PN. Hodi adapta ba protokolu ne'ebé publika ona antes, PNs hetan purifikasaun hosi serebelu rate nian iha faze espesífiku ida (58). Ho liafuan badak, serebelu hetan dissesaun no tesi iha meiu dissosiasaun malirin hanesan jelu [lahó HBSS Ca2+ no Mg2+, suplementa ho glikóze 20 mM, penisilina (50 U/ml) no estreptomisina (0.05 mg/ ml)], no hafoin ne'e dijere meiu iha papain [HBSS, suplementa ho steína HBSS, 1·1 (1 mg / ml), papain (16 U / ml) no deoxyribonuclease I (DNase I; 0.1 mg/ml)] Trata durante minutu 30 iha 30°C. Primeiru fase tesidu sira iha meiu HBSS ne'ebé kontein mucus ovo (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) no DNase (0.1 mg/ml) iha temperatura ambiente hodi prevene dijestaun enzimátika, no tuirmai iha meiu HBSS ne'ebé kontein 20 mM glikóze Hamoos ho kmaan iha HBSS peillin, strepcin/ml/ml (0.05 mg/ml) no DNase (0.1 mg/ml) hasai sélula mesak sira. Suspensaun sélula ne'ebé rezulta filtra liuhosi filtru sélula 70μm, hafoin sélula sira hetan pelet liuhosi sentrifugasaun (1110 rpm, minutu 5, 4°C) no suspende fali iha meiu klasifikasaun [HBSS, suplementadu ho glikóze 20 mM, 20% bovinu feto nian ) Sérum, pelina (50/5) estrep (0.05 mg/ml)]; avalia viabilidade sélula nian ho iodu propídiu no ajusta densidade sélula nian ba 1×106 to'o 2×106 sélula/ml. Molok sitometria fluxu, suspensaun ne'e filtra liuhosi filtru sélula 50 μm.
Sitómetru fluxu nian. Triajen sélula nian hala'o iha 4°C uza mákina FACSAria III (BD Biosciences) no software FACSDiva (BD Biosciences, versaun 8.0.1). Suspensaun sélula nian klasifika uza bico 100 μm ho presaun 20 psi ho taxa ~2800 eventu/seg. Tanba kritériu gating tradisionál (medida sélula, diskriminasaun bimodal, no karakterístika espallamentu) labele asegura izolamentu ne'ebé loos ba PN hosi tipu sélula sira seluk, estratéjia gating nian estabelese bazeia ba komparasaun direta hosi intensidade YFP no autofluoressénsia iha mitoYFP+ ​​no kontrolu mitoYFP − Rate sira. YFP hetan eksitasaun liuhosi irradiasaun ba amostra ho liña laser 488 nm, no sinál hetan detekta uza filtru pasajen banda 530/30 nm. Iha rate mitoYFP+, forsa relativu hosi jéniku repórter Rosa26-mitoYFP mós uza hodi distinge korpu neuronál no fragmentu axon sira. 7-AAD hetan eksitasaun ho laser mean 561 nm no detekta ho filtru bandpass 675/20 nm hodi esklui sélula mate sira. Atu haketak astrosita sira iha tempu hanesan, suspensaun sélula nian hetan ko'a ho ACSA-2-APC, hafoin amostra hetan irradiasaun ho liña laser 640 nm, no filtru 660/20 nm uza hodi detekta sinál.
Sélula sira ne'ebé halibur ona halo pelet liuhosi sentrifugasaun (1110 rpm, minutu 5, 4°C) no rai iha -80°C to'o uza. Rate Mfn2cKO no sira nia oan sira klasifika iha loron hanesan atu minimiza variabilidade prosedimentu nian. Aprezentasaun no análize dadus FACS nian hala'o uza software FlowJo (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, EUA).
Hanesan temi ona iha leten (59), PCR tempu-reál uza hodi izola DNA hosi neuron sira ne'ebé maka klasifika ona ba kuantifikasaun mtDNA tuirmai. Linearidade no sensibilidade limiar inisialmente koko liuhosi hala'o qPCR iha númeru sélula oioin. Ho liafuan badak, halibur 300 PN iha lysis buffer ne'ebé kompostu husi 50 mM tris-HCl (pH 8.5), 1 mM EDTA, 0.5% Tween 20 no proteinase K (200 ng/ml) no inkuba iha 55°C durante minutu 120. Sélula sira inkuba liután iha 95°C durante minutu 10 hodi asegura inativasaun kompletu hosi proteinase K. Uza sonda TaqMan (Thermo Fisher) espesífiku ba mt-Nd1, mtDNA sukat liuhosi PCR semi-kuantitativu iha sistema 7900HT Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientifics). Siénsia, númeru katálogu Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, númeru katálogu AIVI3E8) no 18S (Thermo Fisher Scientific, númeru katálogu Hs99999901_s1) jéniku sira.
Preparasaun amostra proteoma nian. Hodi manas solusaun iha 95°C durante minutu 10 no halo sonikasaun, iha tampón lize [6 M kloridu guanidina, 10 mM tris(2-karboksietil) fosfina hidrokloridu, 10 mM kloroasetamida no 100 mM tris-lize ne'ebé konjeladu iha pellet neuron HC]. Iha Bioruptor (Diagenode) durante minutu 10 (pulsa segundu 30 / períodu pauza segundu 30). Amostra ne'e diluídu 1:10 iha 20 mM tris-HCl (pH 8.0), kahur ho 300 ng trypsin gold (Promega), no inkuba durante kalan ida iha 37°C hodi hetan dijestaun kompletu. Iha loron daruak, amostra hetan sentrifugasaun iha 20,000 g durante minutu 20. Supernatante ne'e diluídu ho ásidu fórmiku 0.1%, no solusaun ne'e hasai masin ho StageTips ne'ebé halo rasik. Amostra ne'e maran iha instrumentu SpeedVac (konsentradór Eppendorf no 5305) iha 45°C, no depois peptide ne'e suspende iha ásidu fórmiku 0.1%. Amostra hotu-hotu prepara simultaneamente hosi ema ne'ebé hanesan. Atu analiza amostra astrosita sira, 4 μg peptide sira ne'ebé laiha masin hetan marka ho tag massa tandem (TMT10plex, númeru katálgu 90110, Thermo Fisher Scientific) ho rásiu reajente peptide ba TMT 1:20. Ba markajen TMT, 0.8 mg husi reajente TMT nian suspende fali iha 70 μl husi ACN anidru, no peptide maran ne'e rekonstitui ba 9 μl husi 0.1 M TEAB (bikarbonatu trietilamóniu), ne'ebé aumenta 7 μl husi reajente TMT iha ACN. Konsentrasaun maka 43.75%. Hafoin minutu 60 inkubasaun nian, reasaun ne'e hamate ho 2 μl husi 5% hidroxilamina. Peptide sira ne'ebé marka ona rekolla, maran, suspende fali iha 200μl husi 0.1% ásidu fórmiku (FA), fahe ba rua, no hafoin hasai masin uza StageTips ne'ebé halo rasik. Uza UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph (UltiMate 3000 ultra high performance liquid chromatograph), ida hosi metade rua ne'e fraksiona iha koluna kromatográfika Acquity 1mm x 150mm ne'ebé nakonu ho partikula C18 130Å1.7μm (Waters, katálgu SKU: 1966). Thermo Fisher Scientific). Haketak peptide sira ho taxa fluxu 30μl/min, haketak hosi 1% to'o 50% buffer B durante minutu 85 ho gradiente etapa-etapa minutu 96, hosi 50% to'o 95% buffer B durante minutu 3, hafoin minutu 8 ba 95 % Buffer B; Tampón A maka 5% ACN no 10 mM bikarbonatu amóniu (ABC), no tampón B maka 80% ACN no 10 mM ABC. Halibur frasaun sira kada minutu 3 no kombina sira ba grupu rua (1 + 17, 2 + 18, nst.) no maran sira iha sentrifuga vákuu.
Análize LC-MS/MS. Ba espektrometria massa, peptide sira (númeru r119.aq) haketak iha koluna analítika PicoFrit ho diámetru interiór 25 cm, 75 μm (objetivu foun, númeru parte PF7508250) ne'ebé ekipadu ho médiu ReproSil-Pur 120 C18-AQ 1.9 μm (Maischr, Maisch-AQD). 1200 (Thermo Fisher Scientific, Alemaña). Koluna ne'e mantein iha 50°C. Tampón A no B maka 0.1% ásidu fórmiku iha bee no 0.1% ásidu fórmiku iha 80% ACN, respetivamente. Péptidu sira haketak ho gradiente etapa-ba-etapa 200 nl/min hosi 6% to'o 31% tampón B durante minutu 65, no hosi 31% to'o 50% tampón B durante minutu 5. Peptide sira ne'ebé elui ona analiza iha espektrómetru massa Orbitrap Fusion (Thermo Fisher Scientific). Sasukat m/z prekursór peptide nian hala'o ho rezolusaun 120,000 iha intervalu 350 to'o 1500 m/z. Uza enerjia kolizaun normalizadu 27%, prekursór ne'ebé maka'as liu ho estadu karga 2 to'o 6 maka hili ba dissosiasaun armadilha C ho enerjia aas (HCD). Tempu siklu nian maka 1 s. Valór m/z husi fragmentu peptide nian sukat iha armadilha ion nian uza alvu AGC ki'ik liu 5×104 no tempu injesaun másimu 86 ms. Hafoin fragmentasaun, prekursór tau iha lista eskluzaun dinámiku durante 45 s. Péptidu sira ho marka TMT haketak iha koluna Acclaim PepMap 50 cm, 75 μm (Thermo Fisher Scientific, númeru katálgu 164942), no espektru migrasaun sira analiza iha espektrómetru massa Orbitrap Lumos Tribrid (Thermo Fisher Scientific) ne'ebé ekipadu ho forma simétriku onda aas (IMS) ekipamentu (Thermo Fisher Scientific) funsiona iha tensaun kompensasaun rua husi −50 no −70 V. MS3 ne'ebé hili bazeia ba prekursór sinkronizasaun nian uza ba sasukat sinál ion relatóriu TMT nian. Separasaun peptide hala'o iha EASY-nLC 1200, uza eluisaun gradiente lineár 90%, ho konsentrasaun tampón 6% to'o 31%; tampón A maka 0.1% FA, no tampón B maka 0.1% FA no 80% ACN. Koluna analítika funsiona iha 50°C. Uza FreeStyle (versaun 1.6, Thermo Fisher Scientific) hodi fahe arkivu orijinál tuir tensaun kompensasaun FAIMS nian.
Identifikasaun no kuantifikasaun proteína nian. Uza motor peskiza Andromeda integradu, dadus orijinál sira analiza uza MaxQuant versaun 1.5.2.8 (https://maxquant.org/). Aleinde sekuénsia Cre recombinase no YFP ne'ebé hetan hosi Aequorea victoria, espektru fragmentu peptide nian sira buka ba sekuénsia kanónika no sekuénsia isoforma hosi proteoma referénsia rate nian (Proteome ID UP000000589, download hosi UniProt iha Maiu 2017). Oxidasaun metionina no asetilasaun N-terminál proteína nian maka tau hanesan modifikasaun variável sira; metilasaun karbamoil sisteina nian maka tau hanesan modifikasaun sira ne'ebé metin. Parámetru sira dijestaun nian maka "espesifisidade" no "tripsina/P". Númeru mínimu hosi peptide sira no peptide sira ne'ebé uza ba identifikasaun proteína nian maka 1; númeru mínimu hosi peptide úniku sira maka 0. Iha kondisaun sira hosi korrespondénsia mapa peptide nian, taxa identifikasaun proteína nian maka 0.01. Opsaun "Peptide Segundu" ativa ona. Uza opsaun "koresponde entre halai" hodi transfere identifikasaun susesu entre arkivu orijinál oioin. Uza kontajen rasio mínimu LFQ 1 ba kuantifikasaun lahó rótulu (LFQ) (60). Intensidade LFQ nian filtra ba pelumenus valór válidu rua iha pelumenus grupu jenotipu ida iha pontu tempu ida-idak, no estrapola hosi distribuisaun normál ho luan ida. 0.3 no tun 1.8. Uza plataforma komputasaun Perseus (https://maxquant.net/perseus/) no R (https://r-project.org/) hodi analiza rezultadu sira LFQ nian. Teste t moderadu rua-dalan husi pakote software limma uza ba análize espresaun diferensiál (61). Análize dadus esploratóriu hala'o uza ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally no pheatmap. Dadus proteómika bazeia ba TMT analiza uza MaxQuant versaun 1.6.10.43. Buka dadus proteómiku brutu sira hosi baze-dadus proteómiku umanu UniProt nian, ne'ebé maka download iha Setembru 2018. Análize inklui fatór koresaun pureza isótopu nian ne'ebé fornese hosi fabrikante. Uza limma iha R ba análize espresaun diferensiál. Dadus orijinál, rezultadu peskiza baze-dadus nian, no fluxu serbisu no rezultadu sira análize dadus nian hotu-hotu rai iha aliansa ProteomeXchange liuhosi repozitóriu parseiru PRIDE ho identifikadór konjuntu dadus PXD019690.
Anotasaun funsionál sira enrikese análize. Instrumentu Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) uza hodi determina rikusoin hosi termu anotasaun funsionál sira hosi konjuntu dadus iha semana 8 (Figura 1). Ho liafuan badak, lista proteína kuantitativu ne'ebé hetan hosi análize dadus LC-MS/MS (espektrometria massa tandem) uza ho kritériu filtru tuirmai: Mus musculus maka hili hanesan espésie no background, no kategoria hatudu valór P ne'ebé ajusta hosi Benjamini ba enrikesimentu 0.05 ka ki'ik liu konsidera signifikativu. Ba gráfiku ida-ne'e, hatudu kategoria exsesu lima ne'ebé aas liu iha agrupamentu ida-idak bazeia ba valór P ne'ebé ajusta ona. Uza t-test múltiplu, uza programa impulsu lineár etapa rua hosi Benjamini, Krieger, no Yekutieli (Q = 5%), análize espresaun proteína kursu-tempu nian hala'o iha kandidatu importante sira ne'ebé identifika iha kategoria ida-idak, no liña ida-idak analiza ketak. La presiza atu adota SD ida ne'ebé konsistente.
Atu kompara rezultadu sira husi estudu ida-ne'e ho baze-dadus sira ne'ebé publika ona no hamosu diagrama Venn iha Figura 1, ami kombina lista proteina kuantitativu ho anotasaun MitoCarta 2.0 (24). Uza ferramenta online Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) hodi hamosu diagrama.
Ba informasaun detallu kona-ba prosedimentu estatístiku sira ne'ebé uza ba análize proteómika, favór haree ba seksaun korrespondente hosi Materiál no Métodu sira. Ba esperimentu sira seluk hotu, informasaun detallu bele hetan iha lejenda ne'ebé korresponde. Eseptu espesifikasaun seluk, dadus hotu-hotu espresa hanesan média ± SEM, no análize estatístika hotu-hotu hala'o uza software GraphPad Prism 8.1.2.
Ba materiál suplementár sira ba artigu ida-ne'e, favór haree http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1
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Husi E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Análize proteómika hosi neurona disfunsionál sira hatudu katak programa metabóliku sira ativadu hodi kontra neurodejenerasaun.
Husi E. Motori, I. Atanassov, SMV Kochan, K. Folz-Donahue, V. Sakthivelu, P. Giavalisco, N. Toni, J. Puyal, N.-G. Larson
Análize proteómika hosi neurona disfunsionál sira hatudu katak programa metabóliku sira ativadu hodi kontra neurodejenerasaun.
©2020 Asosiasaun Amerikana ba Avansu Siénsia nian. direitu hotu-hotu rezervadu. AAAS hanesan parseiru husi HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef no COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.