Agora†Enderesu atuál: OX11 0DE, Reinu Unidu, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Reinu Unidu, Diamond Light Source Co., Ltd., Electronic Biological Imaging Center.
Sentru reasaun kompleksu kolleita naroman 1 (RC-LH1) maka komponente fotosintétiku sentrál hosi baktéria fototrófiku kór-roxu. Ami introdús estrutura mikroskopia krio-eletróniku rua hosi kompleksu RC-LH1 hosi Rhodopseudomonas palustris. Estrutura rezolusaun 2.65-Å husi kompleksu RC-LH114-W kompostu husi 14 subunit LH1 loops ne'ebé hale'u RC, ne'ebé hetan interrupsaun husi proteina W, enkuantu kompleksu lahó proteina-W maka kompletamente kompozisaun RC ne'ebé hale'u husi RC. Taka 16 subunit LH1 loop. Komparasaun husi estrutura sira-ne'e fornese hanoin sira kona-ba dinámika husi quinone iha kompleksu RC-LH1, inklui mudansa konformasionál sira ne'ebé la determina antes bainhira liga quinone iha fatin RC QB, no mós lokalizasaun husi fatin ligasaun quinone auxiliar, ne'ebé ajuda Pasa sira ba RC. Estrutura úniku hosi proteína W prevene taka hosi lasu LH1, nune'e kria kanál ida hodi aselera troka quinone/quinolone.
Enerjia ne'ebé fornese hosi fotosínteze bele sustenta kuaze moris hotu iha rai, no iha potensiál boot ba bioteknolojia solar. Enkuantu promove fotosínteze globál, baktéria fototrófiku kór-roxu mós hatudu modu enerjia oioin no kapasidade metabóliku sira. Sira bele evita fotosínteze no moris hanesan baktéria heterotrófika iha nakukun, bele hadi'a nitrojéniu no dióxidu karbonu, produz idrojéniu, no degrada kompostu aromátiku sira (1-3). Atu fornese enerjia ba prosesu sira-ne'e, naroman tenke konverte lalais no efisiente ba enerjia kímika. Prosesu ida-ne'e hahú bainhira kompleksu antena ne'ebé kaer naroman absorve naroman no transfere enerjia ne'ebé kaer ba sentru reasaun (RC), nune'e hahú separasaun karga (4 – 7). Unidade báziku fotosínteze nian iha baktéria fototrófiku kór-roxu nian kompostu hosi tipu 2 RC, ne'ebé hale'u hosi kompleksu kolleita-naroman 1 (LH1), ne'ebé forma kompleksu núkleu RC-LH1. LH1 forma hosi array ida hosi heterodímeru αβ kurvadu, ida-idak ne'ebé liga ba molékula klorofíl (BChl) baktéria rua no karotenóide ida ka rua (8-12). Antena LH1 ne'ebé simples liu kompostu hosi heterodímeru αβ 16 ka 17 ne'ebé hale'u RC (9-13) iha loop taka, maibé iha kompleksu núkleu sira seluk, péptidu transmembrana sira interompe kontinuidade hosi LH1 ne'ebé hale'u, nune'e promove difuzaun kinol/kinona entre RC no kompleksu sitokrom bc (1111, 13). Ai-horis fototrófiku kór-roxa Rhodopseudomonas (Rps.) maka organizmu modelu ida ne'ebé bele komprende enerjia no transferénsia eletróniku ne'ebé suporta fotosínteze. Estrutura kristal dahuluk husi Rps. Modelu husi kompleksu palustris RC-LH1 maka RC, ne'ebé hale'u husi loop LH1 heterodimériku 15, ne'ebé hetan interrupsaun husi proteína deskoñesidu ida ne'ebé hanaran “Proteina W” (14). Proteina-W tuirmai identifika hanesan RPA4402, ne'ebé maka proteina 10.5kDa ne'ebé la karakteriza ho hélice transmembrana (TMH) tolu ne'ebé prevee ona (16). Ami propoin atu muda naran ba jéniku rpa4402 ne'ebé kode proteína W ba pufW atu sai konsistente ho nomenklatura ne'ebé uza ba jéniku sira ne'ebé kode subunidade RC-L, M (pufL, pufM) no LH1α, β (pufA, pufB). Interesante, proteína-W prezente de'it iha besik 10% hosi RC-LH1, ne'ebé hatudu Rps. palustris produz kompleksu RC-LH1 rua ne'ebé diferente. Iha ne'e, ami relata estrutura krio-EM (krio-EM) ho rezolusaun aas hosi kompleksu núkleu rua, ida ho proteína W no 14 αβ heterodímeru, ida seluk lahó proteína W no loop 16 Heterodímeru LH1 ne'ebé taka. Ami nia estrutura reprezenta mudansa etapa ida iha komprensaun kona-ba kompleksu RC-LH1 husi Rps. palustris, tanba ami analiza ona populasaun omojéneu hosi variante ida-idak no iha rezolusaun sufisiente atu atribui ho klaru peptide ida-idak no pigmentu sira ne'ebé ligadu no lípidu no kinona sira ne'ebé relasionadu. Komparasaun husi estrutura sira-ne'e hatudu katak proteína TMH tolu-W ne'ebé maka seidauk hetan iha kompleksu RC-LH1 seluk to'o agora hamosu kanál quinone ida hodi aselera troka quinone/quinolone. Númeru ida hosi fatin ligasaun lípidu no quinona konservadu sira identifika ona, no ami revela ona mudansa konformasionál foun ida hafoin kombinasaun quinona no RC, ne'ebé bele sai apropriadu ba fotosistema II (PSII) RC hosi organizmu fototrófiku sira ne'ebé iha oksijéniu. Ami nia deskobrimentu sira fornese hanoin foun sira kona-ba sinétika ligasaun no troka quinone/quinolone iha kompleksu núkleu RC-LH1 husi baktéria fototrófiku kór-roxu.
Atu nune'e bele fasilita estudu detallu ida kona-ba kompleksu rua ne'ebé hetan iha Rps. palustris, ami izola RC-LH1 ida-idak liuhosi métodu biokímiku sira. Komplexu proteina W-defisiente (iha ne'e refere hanesan ΔpufW) hetan purifikasaun hosi estirpe ne'ebé laiha jéniku pufW (16), no kompleksu RC-LH1 ida de'it maka bele produz. Komplexu ne'ebé kontein proteína W maka produz hosi estirpe ida. Proteina W husi estirpe ida-ne'e modifika ho tag His 10x iha nia C-terminus, atu nune'e kompleksu ne'ebé kontein proteína W bele kombina ho efetivu ho proteína W ne'ebé laiha liu liuhosi imobiliza metal. Komplexu ne'e haketak ho efetivu (16) Kromatografia Afinidade (IMAC).
Hanesan hatudu iha Figura 1, kompleksu rua ne'e kontein RC sub-unidade tolu (RC-L, RC-M no RC-H) ne'ebé hale'u ho antena LH1. Estrutura 2.80-A hosi kompleksu ne'ebé laiha proteína-W hatudu heterodímeru αβ 16, ne'ebé forma lasu LH1 taka ida ne'ebé hale'u kompletamente RC, tuirmai refere hanesan kompleksu RC-LH116. Estrutura 2.65Å hosi kompleksu ne'ebé kontein proteína-W iha heterodímeru 14 LH1 ne'ebé interrompe hosi proteína-W, ne'ebé tuirmai refere hanesan RC-LH114-W.
(A no B) Reprezentasaun superfísie hosi kompostu. (C no D) Pigmentu sira ne'ebé ligadu ne'ebé espresa iha ai-sanak sira. (E no F) Komplexu sira ne'ebé observa hosi superfísie sitoplazmátiku iha péptidu sira no subunidade LH1 sira ne'ebé reprezenta iha desenho animadu sira, no hetan numeru iha diresaun relójiu hosi lakuna proteína-W [konsistente ho numerasaun Rba. sphaeroides complex (13)]. Ba LH1-α, kór hosi subunidade proteína nian maka mean; ba LH1-β, kór hosi subunidade proteína nian maka azul; ba proteína-W, proteína ne'e mean; ba RC-H, ida-ne'e maka cyan; ba RC-L, ida-ne'e kór laranja; ba RC-M, magenta. Kofatór sira reprezenta hosi ai-sanak sira, kór verde reprezenta molékula BChl no BPh a, kór-roxu reprezenta karotenóide sira, no kór-mean reprezenta molékula UQ10. (G no H) Vizaun ne'ebé aumenta hosi lakuna proteína-W iha rejiaun ekivalente hosi kompleksu RC-LH114-W (G) no kompleksu RC-LH116 (H). Kofatór sira hatudu iha forma preenxe espasu nian, kinona kelatadu hatudu iha kór azul. Lakuna proteina-W destaka ho liña traseadu azul iha (G), no kuak ki'ik sira iha ne'ebé quinone/quinolol difuzaun iha anel LH116 destaka ho liña traseadu metan iha (H).
Figura 1 (A no B) hatudu RC ne'ebé hale'u hosi array nakloke ka taka hosi heterodímeru LH1αβ, ida-idak ne'ebé liga BChl rua no karotenóide ida (Figura 1, C no D). Estudu sira uluk hatudu katak Rps maka kompleksu LH1. Iha dalan biosinteze husi spirulina xanthin, espésie sira-ne'e kontein populasaun karotenóide sira ne'ebé kahur (17). Maibé, spiropirroxantina maka karotenóide dominante no nia densidade satisfatóriu. Tanba ne'e, ami hili atu modela spiroxantina iha fatin ligasaun LH1 hotu-hotu. Polipéptidu alfa no beta maka TMH mesak ho rejiaun liur membrana badak (Figura 1, A, B, E, no F). Maske la observa densidade hosi rezíduu 17 iha C-terminus, polipéptidu alfa hetan fahe hosi Met1 ba Ala46 iha kompleksu rua ne'e. β polipéptidu hetan redusaun husi Gly4 ba Tyr52 iha RC-LH116, no husi Ser5 ba Tyr52 iha RC-LH114-W. Laiha densidade husi 3 ka 4 N-terminal ka 13 C-terminal restu sira ne'ebé maka observa (Figura S1). Análize espektrometria massa husi kompleksu RC-LH1 mistu ne'ebé prepara husi estirpe tipu selvajen hatudu katak rejiaun ne'ebé lakon maka rezultadu husi cleavage heterólogu husi peptide sira-ne'e (Figura S1 no S2). Formilasaun N-terminál husi α-Met1 mós hetan observasaun (f). Análize hatudu katak α-peptide kompostu husi rezíduu fMet1 to'o Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, no β-peptide kompostu husi rezíduu Ser2 to'o Ala53, ne'ebé iha akordu di'ak ho mapa densidade EM ho temperatura ki'ik.
Koordenasaun husi α-His29 no β-His36 halo BChls hasoru malu; heterodímeru αβ ida-idak halibur ho nia viziñu sira hodi forma loop nakloke (RC-LH114-W) ka loop taka (RC-LH116) hale'u RC Array pigment akopladu exciton (Figura 1, C no D). Kompara ho banda 877 nm husi RC-LH114-W, mudansa mean absorsaun 880 nm husi RC-LH116 maka 3 nm (Figura 2A). Maibé, espektru dikroizmu sirkulár kuaze hanesan (Figura 2B), ne'ebé indika katak maski iha diferensa klaru entre loop nakloke no taka, ambiente lokál BChls nian hanesan tebes. Redshift absorsaun nian bele sai rezultadu hosi redusaun movimentu termál no aumentu estabilidade iha lasu taka (18, 19), mudansa iha akoplamentu pigmentu ne'ebé kauza hosi lasu taka (20, 21), ka kombinasaun hosi efeitu rua ne'e (11).
(A) Espektru absorsaun ultravioleta/vizivel/besik infra-mean, ne'ebé nia pontu aas sira marka ho sira nia pigmentu korrespondente no normaliza ba pontu aas BPh iha 775 nm. (B) Espektru dikroizmu sirkulár normalizadu ba absorbánsia BChl iha 805 nm. (C no D) Espektru ΔA ne'ebé hili hosi espektru absorsaun ne'ebé rezolve iha tempu hosi kompleksu RC-LH114-W (C) no kompleksu RC-LH116 (D). Ba komparabilidade ne'ebé di'ak liu, espektru hotu-hotu normaliza ba ∆A husi −A iha 0.2 ps. (E) Taxa oxidasaun sitokroma c2 hafoin irradiasaun iha prezensa konsentrasaun oioin UQ2 nian (haree Figura S8 ba dadus brutu). (F) Iha sélula sira ne'ebé moris iha naroman ho intensidade ki'ik, médiu ka aas (10, 30 ka 300μMm-2 s-1, respetivamente), subunidade proteína W no RC-L iha kompleksu purifikadu no rásiu membrana ne'ebé haketak. Determina nivel proteína liuhosi eletroforeze SDS-poliakrilamida no imunoensaiu (haree Figura S9 ba dadus brutu). Determina rásiu relativu ba kompleksu RC-LH114-W ne'ebé purifika ona. Rasio estekiométriku husi RC-L ba proteína-W husi kompleksu maka 1:1.
BChls iha pozisaun 1 iha loop αβ14 deformadu husi RC-LH114-W (Figura 1, A, C, no E) besik liu ba doadór primáriu RC (P) ho 6.8Å duké BChls ekivalente iha RC-LH116 (Figura. 1, B, D, no F, no S3); maske nune'e, kinétika absorsaun tranziente hosi kompleksu rua ne'e hatudu katak ba RC-LH114-W no RC-LH116, konstante tempu transferénsia enerjia eksitasaun nian hosi LH1 ba RC maka 40 ±4 no 44±3 ps (Figura 2). , C no D, Figura S4 no Tabela S2). Laiha mós diferensa signifikativa iha transferénsia eletróniku iha RC nia laran (Figura S5 no testu suplementár relasionadu). Ami deskonfia katak korespondénsia besik hosi tempu transferénsia enerjia entre LH1 no RC-P tanba distánsia, ângulu no enerjia potensiál ne'ebé hanesan hosi maioria BChl iha loop LH1 rua. Parese katak esplora padraun enerjia LH1 nian hodi atinji distánsia mínimu la'ós lalais liu duké transferénsia enerjia direta hosi fatin sira ne'ebé ladún di'ak ba RC. Lasu LH1 ho lasu nakloke iha RC-LH114-W bele mós hetan movimentu termál ne'ebé la signifikativu iha kondisaun temperatura ki'ik ba análize estruturál, no iha konformasaun anel αβ14 ne'ebé naruk liu iha temperatura ambiente hosi distánsia pigmentasaun βBChls iha pozisaun RC 1.
Komplexu RC-LH116 kontein 32 BChls no 16 carotenoids, no nia arranju jerál hanesan ho ida ne'ebé hetan hosi Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) DB (PDB) strain (IDC 2979) no alga verde (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Hafoin aliñamentu, observa de'it desviu ki'ik sira iha pozisaun heterodímeru αβ nian, liuliu 1-5, 15, no 16 (Figura S6). Prezensa proteina-W nian iha impaktu signifikativu ba estrutura LH1 nian. Ninia TMH tolu liga ho lasu badak sira, ho N-terminal iha parte lumen kompleksu nian no C-terminal iha parte sitoplazmátiku (Figura 1A no 3, A to'o D). Proteina-W maka barak liu hidrofóbiku (Figura 3B), no TMH2 no TMH3 interasaun ho LH1αβ-14 hodi forma superfísie transmembrana (Figura 3, B no E to'o G). Interfase ne'e kompostu liuliu hosi rezíduu Phe, Leu no Val iha rejiaun transmembrana. Rezidu sira-ne'e tau hamutuk ho amino asidu hidrofóbiku no pigmentu αβ-14. Rezidu polar balu mós kontribui ba interasaun, inklui ligasaun hidrojéniu entre W-Thr68 no β-Trp42 iha superfísie kavidade kompleksu nian (Figura 3, F no G). Iha superfísie sitoplasma nian, Gln34 besik ba grupu keto husi karotenóide αβ-14. Aleinde ne'e, molékula n-dodecyl β-d-maltoside (β-DDM) rezolve ona, no nia ikun hidrofóbiku habelar ba interfase entre proteína-W no αβ-14, no ikun lípidu bele lokaliza iha isin. Ami mós nota katak rejiaun rezolusaun C-terminál sira hosi proteína W no RCH besik tebes, maibé la'ós iha ámbitu formasaun interasaun espesífiku sira (Figura 1, A no E). Maibé, bele iha interasaun sira iha aminoásidu C-terminál sira ne'ebé seidauk rezolve hosi proteína rua ne'e, ne'ebé bele fornese mekanizmu ida ba rekrutamentu proteína-W nian durante montajen hosi kompleksu RC-LH114-W.
(A) Proteina-W, ne'ebé hasoru interfase ho LH1αβ14 iha forma dezeñu animadu, iha korrente laterál ho forma ai-tonka (mean), ne'ebé hatudu iha parte ida hosi diagrama potensiál eletrostátiku (superfísie kinur transparente ho nível kontur 0.13). (B) Proteina-W ne'ebé reprezenta hosi superfísie kór hidrofóbiku. Área polar no karregadu sira hatudu iha kór cyan, área hidrofóbiku sira hatudu iha kór mutin, no área sira ne'ebé hidrofóbiku maka'as hatudu iha kór laranja. (C no D) Proteina-W ne'ebé reprezenta iha dezeñu animadu, nia orientasaun hanesan ho (A) (C), no rota ho 180° (D). Tuir pozisaun iha sekuénsia, rezíduu sira ne'ebé bele distinge adota eskema kór arko-íris nian, iha ne'ebé N-terminal maka azul no C-terminal maka mean. (E) Proteina-W iha vizaun hanesan iha (A), no rezíduu sira iha interfase proteína-W:LH1 nian reprezenta hosi ai-sanak sira ho marka sira ne'ebé anexa. (F) Proteina-W hetan rotasaun 90° relativamente ba (E) no LH1αβ14 iha reprezentasaun dezeñu animadu, no relativamente ba rezíduu interfase iha reprezentasaun barra. Rezidu sira ne'ebé maka sa'e hosi polipéptidu beta hetan marka. Kofatór hatudu hanesan barra ida ne'ebé hanesan ho kór husi Figura 1, β-DDM ne'ebé dekompostu hatudu ho kinur, no oksijéniu hatudu ho kór mean. (G) Vizaun iha (F) maka rotasaun 180°, ho rezíduu proeminente sira hosi polipéptidu alfa ne'ebé marka ona.
Proteina-W troka heterodímeru αβ ida (ba dala 15 iha Figura 1F), nune'e prevene taka loop no halo inklinasaun ba heterodímeru αβ tolu dahuluk. Observa katak ângulu inklinasaun másimu hosi heterodímeru αβ-1 dahuluk relativamente ba filme normál maka 25° to'o 29° (Figura 1, A no E), ne'ebé forma hosi inklinasaun 2° to'o 8° hosi αβ-1 iha RC A ho kontraste maka'as-LH116 (Figura 1, B no F). Heterodímeru daruak no datoluk inklina iha 12° to'o 22° no 5° to'o 10°, respetivamente. Tanba obstákulu estériku husi RC, inklinasaun husi αβ-1 la inklui par daruak husi αβ (ne'ebé koresponde ba αβ ba dala 16 iha Figura 1F), nune'e forma lakuna ida ne'ebé klaru iha anel LH1 (Figura 1, A no E). Tanba falta heterodímeru αβ rua, akompaña ho lakon BChl haat no karotenóide rua, laiha karotenóide ida maka liga ba subunidade αβ-1 ne'ebé tortu, hodi rezulta iha anel LH114-W ne'ebé kontein karotenóide 13 Vejetarianu no BChls 28. Estimativa rezolusaun lokál sira hosi kompleksu rua iha rejiaun αβ1 to'o 7 ki'ik liu duké sira hosi restu hosi loop LH1, ne'ebé bele reflete plastisidade inerente hosi subunidade LH1 ne'ebé besik ba fatin RC QB (Figura 4).
Imajen sira husi RC-LH114-W (A no B) no RC-LH116 (C no D) hatudu husi vizaun leten/vizaun sorin ne'ebé hanesan (A no B) (A no C) no superfísie kavidade nian husi Fig. 1. (B no D). Xave kór sira hatudu iha liman-loos.
Komplexu núkleu karakterístika úniku seluk ho rásiu estekiométriku 1:14 maka Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimer (13). Maibé, proteína W no PufX laiha omolojia ne'ebé klaru, no iha impaktu signifikativu ba sira nia estrutura LH1 ida-idak. PufX maka TMH ida de'it ho domíniu sitoplazmátiku N-terminál ne'ebé interaje ho parte sitoplazmátiku hosi subunidade RC-H (13) iha pozisaun ne'ebé koresponde ba Rps. palustris LH116αβ-16. PufX kria kanál ida ba troka quinone/quinolone entre RC-LH1 no kompleksu sitokroma bcl no prezente iha Rba hotu-hotu. kompleksu núkleu sphaeroides (13). Maske interfase monómeru-monómeru iha Rba. Dímeru sphaeroides RC-LH1-PufX lokaliza iha pozisaun ligasaun proteína W nian iha RC-LH114-W, no lakuna ne'ebé induzidu hosi PufX no proteína-W iha pozisaun ekivalente (Figura S7A). Lakuna iha RC-LH114-W mós aliña ho kanál quinone hipotétiku (8) husi Pseudomonas rosea LH1, ne'ebé forma husi peptide sira ne'ebé la iha relasaun ho proteína W ka PufX (Figura S7B). Aleinde ne'e, kanál kinona iha Blc. LH1 verde esmeralda ne'ebé forma liuhosi esklui subunidade γ ida (7) lokaliza iha pozisaun ne'ebé hanesan (Figura S7C). Maski mediadu hosi proteína oioin, aparénsia hosi kanál kinona/kinolol sira-ne'e iha pozisaun komún iha kompleksu RC-LH1 parese sai ezemplu ida hosi evolusaun konverjente, ne'ebé indika katak lakuna ne'ebé kria hosi proteína W bele atua hanesan kanál quinona.
Lakuna iha loop LH114-W permite formasaun rejiaun membrana kontínua entre espasu internu kompleksu RC-LH114-W no membrana boot (Figura 1G), envezde liga domíniu rua liuhosi poru proteína nian hanesan iha proteína sira. Komplexu RC-LH116 hanesan ho Tch taka. Komplexu hanesan agulha (22) (Figura 1H). Tanba difuzaun kinona liuhosi membrana maka lais liu duké difuzaun liuhosi kanál proteína ne'ebé kloot, loop LH114-W nakloke bele permite rotasaun RC ne'ebé lalais liu duké loop LH116 ne'ebé taka, no difuzaun quinona ba RC bele sai restritu liu. Atu koko se proteína W afeta konversaun kinona sira liuhosi RC, ami hala'o ensaiu oxidasaun sitokroma nian iha konsentrasaun sertu ida hosi ubikinona 2 (UQ2) (análoga ida hosi UQ10 naturál ho ikun isoprenu ne'ebé badak liu) (Figura 2E). Maske prezensa husi kinona chelated difikulta determinasaun loloos husi konstante Michaelis aparente (RC-LH114-W no RC-LH116 maka apropriadu ba 0.2±0.1μM no 0.5±0.2μM, respetivamente), taxa másimu husi RC-LH114-W ( 4.6±0.6±0.2μM) maka s-1-1. 28±5% boot liu duké RC-LH116 (3.6±0.1 e-RC-1 s-1).
Ami inisialmente kalkula katak proteína-W prezente iha besik 10% hosi kompleksu núkleu (16); iha ne'e, taxa okupasaun sira hosi sélula kreximentu ho naroman-ki'ik, naroman-médiu, no naroman-boot maka 15±0.6%, 11±1% no 0.9±0.5, respetivamente % (Figura 2F). Komparasaun kuantitativu husi espektrometria massa hatudu katak adisaun husi tag histidine la hamenus abundánsia relativu husi proteina-W kompara ho estirpe tipu selvajen (P = 0.59), nune'e nivel sira-ne'e la'ós artefaktu husi proteina-W ne'ebé modifikadu (Figura S10). Maibé, okupasaun ki'ik ida-ne'e hosi proteína-W iha kompleksu RC-LH1 bele permite RC balu atu nakfilak ho taxa aseleradu, nune'e bele mitiga troka quinone/quinolone ne'ebé neineik liu iha kompleksu RC-LH116. Ami nota katak taxa okupasaun naroman ne'ebé aas la konsistente ho dadus transkriptómiku foin lalais ne'e, ne'ebé indika katak espresaun jéniku pufW aumenta iha naroman maka'as nia okos (Figura S11) (23). Diferensa entre transkrisaun pufW no inkorporasaun proteína-W iha kompleksu RC-LH1 maka konfuzaun no bele reflete regulasaun kompleksu proteína nian.
Iha RC-LH114-W, 6 kardiolipina (CDL), 7 fosfatidilkolina (POPC), 1 fosfatidilgliserol (POPG) no 29 β-DDM molékula sira aloka no modela iha nia 6 CDLs, 24 POPCs, 2 POPGs no 21βDs. RC-LH116 (Figura 5, A no B). Iha estrutura rua ne'e, CDL kuaze lokaliza iha parte sitoplazmátiku kompleksu nian, enkuantu POPC, POPG no β-DDM barak liu lokaliza iha parte luminal. Molékula lípidu no deterjente rua maka izola iha rejiaun αβ-1 to'o αβ-6 hosi kompleksu RC-LH114-W (Figura 5A), no lima maka izola iha rejiaun ekivalente hosi RC-LH116 (Figura 5B ). Hetan lípidu barak liu iha kompleksu nia sorin seluk, liuliu CDL, ne'ebé akumula entre RC no αβ-7 to'o αβ-13 (Figura 5, A no B). Lípidu no deterjente sira seluk ne'ebé rezolve estruturalmente lokaliza iha anel LH1 nia liur, no kadeia asíliku sira ne'ebé rezolve ho di'ak habelar entre subunidade LH1 sira, ne'ebé dezignadu tentativamente hanesan β-DDM iha RC-LH114-W, no define hanesan β-DDM iha RC mistura β-DDM no PO-LH1616. Pozisaun sira ne'ebé hanesan hosi lípidu sira no deterjente sira iha ami nia estrutura indika katak sira maka fatin ligasaun ne'ebé relevante fiziolójikamente (Figura S12A). Pozisaun sira hosi molékula ekivalente sira iha Tch mós iha konsisténsia di'ak. Suave no Trv. Estirpe 970 RC-LH1s (Figura S12, B to'o E) (9, 12) no rezíduu sira ligasaun hidrojéniu nian hosi grupu ulun lípidu nian hatudu konservasaun ne'ebé di'ak iha aliñamentu sekuénsia nian (Figura S13), indika katak CDL konservadu ne'ebé liga ba RC (24), fatin sira-ne'e bele konserva iha kompleksu RCH-LH1.
(A no B) RC-LH114-W (A) no RC-LH116 (B) péptidu sira reprezenta hosi dezeñu animadu sira, no pigmentu sira reprezenta hosi ai-sanak sira, uza eskema kór nian iha Figura 1. Lípidu sira hatudu ho kór mean, no deterjente sira hatudu ho kór kinur. UQ ne'ebé liga ba fatin RC QA no QB maka mean, enkuantu UQ ne'ebé izoladu maka azul. (C no D) Vizaun hanesan ho (A) no (B), ho lípidu sira ne'ebé la tau. (E to'o G) Vizaun ne'ebé aumenta hosi Q1(E), Q2(F) no Q3(G) hosi RC-LH116, ho korrente laterál sira ne'ebé influensia malu. Ligasaun sira hidrojéniu nian hatudu hanesan liña traseadu metan sira.
Iha RC-LH116, tantu RC QA no QB UQ, ne'ebé partisipa iha transferénsia eletróniku iha prosesu separasaun karga, dekompostu iha sira nia fatin ligasaun. Maibé, iha RC-LH114-W, QB quinone seidauk rezolve no sei diskute ho detalle iha kraik. Aleinde kinona QA no QB, molékula UQ chelatadu rua (ne'ebé lokaliza entre anel RC no LH1) aloka iha estrutura RC-LH114-W tuir sira nia grupu ulun ne'ebé rezolve ho di'ak (lokaliza iha Q1 no Q2, respetivamente). espasu). Figura 5C). Unidade isoprene rua maka atribui ba Q1, no mapa densidade rezolve kompletu 10 isoprene tails husi Q2. Iha estrutura RC-LH116, rezolve ona molékula UQ10 chelated tolu (Q1 to'o Q3, Figura 5D), no molékula hotu-hotu iha densidade ne'ebé klaru iha ikun tomak (Figura 5, D to'o G). Iha estrutura rua, pozisaun sira hosi grupu ulun kinona nian hosi Q1 no Q2 iha konsisténsia exelente (Figura S12F), no sira interasaun de'it ho RC. Q1 lokaliza iha entrada husi lakuna W husi RC-LH114-W (Figura 1G no 5, C, D no E), no Q2 lokaliza besik fatin ligasaun QB (Figura 5, C, D) no F). L-Trp143 no L-Trp269 nia restu sira ne'ebé konserva besik tebes ba Q1 no Q2 no fornese interasaun π-stacking potensiál (Figura 5, E no F, no Figura S12). L-Gln88, 3.0 Å husi oksijéniu distal husi Q1, fornese ligasaun hidrojéniu ne'ebé maka'as (Figura 5E); rezíduu ida-ne'e konserva iha RC hotu-hotu exetu relasaun ne'ebé dook liu (Figura S13). L-Ser91 substitui ho konservativu ba Thr iha maioria RC sira seluk (Figura S13), maka 3.8 Angstroms hosi oksijéniu metil Q1 nian, no bele fornese ligasaun hidrojéniu ne'ebé fraku (Figura 5E). Q3 parese la iha interasaun espesífiku, maibé lokaliza iha rejiaun hidrofóbiku entre subunidade RC-M no subunidade LH1-α 5 to'o 6 (Figura 5, D no G). Q1, Q2 no Q3 ka kinona kelatadu sira ne'ebé besik mós rezolve ona iha Tch. Laran-di'ak, Trv. Estirpe 970 no Blc. Estrutura íris (9, 10, 12) hatudu ba fatin ligasaun kinona auxiliár konservadu iha kompleksu RC-LH1 (Figura S12G). UQ lima ne'ebé dekompostu iha RC-LH116 iha akordu di'ak ho 5.8±0.7 hosi kompleksu ida-idak ne'ebé determina hosi kromatografia líkidu ho dezempeñu aas (HPLC), enkuantu UQ tolu ne'ebé dekompostu iha RC-LH114-W ki'ik liu duké Valór ne'ebé sukat 6.2±0.3 (Fig. S14) indika katak laiha rezolusaun ba molékulu sira iha UQ. estrutura.
Polipéptidu pseudo-simétriku L no M ida-idak kontein TMH lima no forma heterodímeru ida ne'ebé kombina dímeru BChl ida, monómeru BChl rua, monómeru bakteriófagu (BPh) rua, no ferru non-Heme ida no molékula UQ10 ida ka rua. Liuhusi prezensa ligasaun hidrojéniu nian iha grupu cetona terminál no ninia akumulasaun ne'ebé koñesidu iha Rps, karotenóide sira inkorpora iha subunidade M, ne'ebé hanaran cis-3,4-dehydroorhodopin. Espésie (25). Domíniu membrana esterna RC-H nian maka ankora ba membrana hosi TMH ida de'it. Estrutura RC jerál hanesan ho RC subunidade tolu hosi espésie sira ne'ebé iha relasaun (hanesan Rba). sphaeroides (PDB ID: 3I4D). Makrosiklu sira husi BChl no BPh, ruin-kotuk karotenoide no ferru la'ós heme nian sobrepoin iha estrutura sira-ne'e nia luan rezolusaun nian, hanesan mós grupu ulun UQ10 iha fatin QA no kinona QB iha RC-LH116 (Figura S15).
Disponibilidade husi estrutura RC rua ho taxa okupasaun fatin QB ne'ebé diferente fornese oportunidade foun ida atu ezamina mudansa konformasaun konsistente ne'ebé akompaña ligasaun kinona QB. Iha kompleksu RC-LH116, quinona QB lokaliza iha pozisaun “proksimál” ne'ebé ligadu tomak (26), maibé separasaun RC-LH114-W laiha quinona QB. Laiha kinona QB iha RC-LH114-W, ne'ebé maka surpreza tanba kompleksu ne'e ativu, liu fali kompleksu RC-LH116 ho quinona QB ne'ebé rezolve estruturalmente. Maske anel LH1 rua ne'e kelata besik kinona neen, lima maka rezolve estruturalmente iha anel RC-LH116 ne'ebé taka, enkuantu tolu de'it maka estruturalmente limitadu iha anel RC-LH114-W ne'ebé nakloke. Dezorden estruturál ne'ebé aumenta ida-ne'e bele reflete substituisaun lalais liu hosi fatin QB RC-LH114-W, kinétika quinone ne'ebé lalais liu iha kompleksu, no aumentu probabilidade atu atravesa loop LH1. Ami sujere katak falta UQ iha fatin RC QB husi RC-LH114-W bele sai rezultadu husi kompleksu ida ne'ebé kompleksu liu no ativu liu, no fatin QB husi RC-LH114-W konjela kedas iha rotasaun UQ Etapa espesífiku (entrada ba fatin QB taka ona) reflete konformasaun husi atividade ida-ne'e.
La ho QB, rotasaun akompañamentu L-Phe217 nian ba pozisaun ida ne'ebé la kompativel ho ligasaun UQ10, tanba sei hamosu kolizaun espasiál ho unidade isoprene dahuluk hosi ikun (Figura 6A). Aleinde ne'e, mudansa konformasaun prinsipál sira ne'ebé klaru maka klaru, liuliu hélice de (hélice badak iha loop entre TMH D no E) iha ne'ebé L-Phe217 muda ba bolsu ligasaun QB no rotasaun L-Tyr223 (Figura 6A ) Atu hakotu ligasaun hidrojéniu ho kuadru M-Ap4 no taka entrada ligasaun QB fatin (Figura 6B). Hélice de pivota iha nia baze, Cα husi L-Ser209 muda ho 0.33Å, enkuantu L-Val221Cα muda ho 3.52Å. Laiha mudansa observavel sira iha TMH D no E, ne'ebé maka superimpoin iha estrutura rua ne'e (Figura 6A). Tuir ami hatene, ida-ne'e maka estrutura dahuluk iha RC naturál ne'ebé taka fatin QB. Komparasaun ida ho estrutura kompletu (QB-bound) hatudu katak molok kinona ne'e redús, presiza mudansa konformasionál ida atu halo nia tama iha kinona. L-Phe217 rota hodi forma interasaun π-stacking ho grupu ulun quinone, no hélice muda ba liur, hodi permite eskeletu L-Gly222 no korrente laterál L-Tyr223 nian atu forma rede ligasaun hidrojéniu ho estrutura ligasaun hidrojéniu ne'ebé estável (Figura 6, A no C).
(A) Dezeñu animadu ne'ebé sobrepoin hosi olograma (korrente L, korrente laranja/M, magenta) no estrutura apo (kinur), iha ne'ebé restu xave sira hatudu iha forma reprezentasaun hanesan ai-tonka. UQ10 reprezenta hosi barra mean ida. Liña pontuadu indika ligasaun hidrojéniu sira ne'ebé forma iha estrutura tomak. (B no C) Reprezentasaun superfísie husi apolipoproteína no estrutura anel tomak, ne'ebé destaka oksijéniu kadeia laterál husi L-Phe217 iha kór-azul no L-Tyr223 iha kór-mean, respetivamente. Subunidade L kór laranja; subunidade M no H la iha kór. (D no E) Apolipoproteína (D) no tomak (E) RC QB sites [kór tuir (A) respetivamente] no Thermophilus thermophilus PSII (verde, azul ho kinona plástiku; PDB ID: 3WU2) Aliña (58).
La espera, maski estrutura oioin hosi RC sira ho defisiénsia QB lahó LH1 disponivel, mudansa konformasionál sira ne'ebé observa iha estudu ida-ne'e seidauk relata antes. Hirak-ne'e inklui estrutura deplesaun QB husi Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) no Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), ne'ebé hotu-hotu kuaze hanesan ho sira nia estrutura QB jerál. Inspesaun besik ba 3PRC hatudu katak molékula deterjente LDAO (Lauryl Dimethyl Amine Oxide) liga iha entrada pozisaun QB nian, ne'ebé bele prevene rearranju ba konformasaun taka. Maske LDAO la dekompostu iha pozisaun hanesan iha 1EYS ka 1OGV, RC sira-ne'e prepara uza deterjente hanesan no tanba ne'e bele produz efeitu hanesan. Estrutura kristal Rba nian. Sphaeroides RC ko-kristalizadu ho sitokromu c2 (PDB ID: 1L9B) mós parese iha fatin QB ne'ebé taka. Maibé, iha kazu ida-ne'e, rejiaun N-terminál hosi polipéptidu RC-M (interasaun ho fatin ligasaun QB liuhosi ligasaun H hosi rezíduu Tyr iha hélice Q) adota konformasaun la naturál, no mudansa konformasionál QB la esplora liután (30 ). Saida maka trankuilidade maka ita seidauk haree tipu deformasaun ida-ne'e hosi polipéptidu M iha estrutura RC-LH114-W, ne'ebé kuaze hanesan ho rejiaun N-terminal hosi RC-LH116 RC. Tenke mós nota katak hafoin eradikasaun antena LH1 bazeia ba deterjente, RC apolipoproteína sira iha PDB rezolve ona, ne'ebé halakon piscina internu quinone no lípidu sira iha lakuna entre RC no superfísie internu hosi anel LH1 ne'ebé hale'u (31, 32). RC funsionál nafatin tanba nia mantein kofatór hotu-hotu, exetu ba kinona QB dekomposável, ne'ebé ladún estavel no dala barak lakon durante prosesu preparasaun (33). Aleinde ne'e, hatene katak hasai LH1 no lípidu síkliku naturál sira hosi RC bele iha impaktu ba funsaun sira, hanesan vida badak hosi estadu P+QB ne'ebé haketak ho karga (31, 34, 35). Tanba ne'e, ami espekula katak ezisténsia hosi anel LH1 lokál ne'ebé hale'u RC bele mantein fatin QB "taka", nune'e prezerva ambiente lokál besik QB.
Maske apolipoproteína (lahó kinona QB) no estrutura kompletu reprezenta de'it instantánea rua hosi rotasaun hosi fatin QB, envezde série eventu sira, iha indikasaun sira katak ligasaun bele taka hodi prevene ligasaun filafali hosi hidrokinona Atu inibi inibisaun substratu. Interasaun husi quinolol no quinone besik fatin QB husi apolipoproteina bele diferente, ne'ebé lori ba nia rejeisaun husi RC. Propoin kleur ona katak mudansa konformasionál sira iha papél iha ligasaun no redusaun kinona sira-nian. Abilidade husi RC sira ne'ebé konjeladu atu hamenus kinona sira hafoin adaptasaun nakukun nian hetan prejuízu (36); Kristalografia raiu-X hatudu katak estragu ida-ne'e tanba QB quinones ne'ebé maka dadur iha konformasaun "distál" besik 4.5 Å hosi pozisaun proksimál ativu (26) , 37). Ami sujere katak konformasaun ligasaun distál ida-ne'e maka imajen ida hosi estadu intermédiu entre apolipoproteína no estrutura anel kompletu, ne'ebé tuir interasaun inisiál ho kinona no abertura hosi fatin QB.
RC tipu II ne'ebé hetan iha kompleksu PSII hosi baktéria fototrófiku balu no sianobaktéria, alga no ai-horis sira iha konservasaun estruturál no funsionál (38). Alineamentu estruturál ne'ebé hatudu iha Figura 6 (D no E) subliña semellansa entre PSII RCs no fatin QB hosi kompleksu RC baktéria nian. Komparasaun ida-ne'e sai hanesan modelu ida ba tempu naruk hodi estuda sistema sira ne'ebé iha relasaun besik hosi ligasaun no redusaun kinona nian. Publikasaun anteriór sira sujere katak mudansa konformasionál sira akompaña ho redusaun PSII husi kinona sira (39, 40). Tanba ne'e, konsidera konservasaun evolusionáriu RC nian, mekanizmu ligasaun ne'ebé uluk la observa bele mós aplikavel ba fatin QB PSII RC nian iha ai-horis fototrófiku sira ne'ebé iha oksijéniu.
Rps ΔpufW (delesaun pufW ne'ebé la marka) no PufW-His (C-terminal 10x His-tagged protein-W ne'ebé espresa hosi lokus pufW naturál) estirpe sira. palustris CGA009 deskreve ona iha ami nia serbisu anteriór (16). Estirpe sira-ne'e no inan-aman tipu selvajen isojéniku hetan rekuperasaun hosi konjelador liuhosi hatama númeru ki'ik ida hosi sélula sira iha PYE (ida-idak 5 g litru -1) (rai iha LB iha -80 °C, ne'ebé kontein 50% ( w/v) gliserol) proteína, extratu fermentu no agar suksinatu [1.5%) (v/v) plaka. Xapa ne'e inkuba durante kalan iha nakukun iha temperatura ambiente iha kondisaun anaeróbiku, no hafoin ne'e ilumina ho naroman mutin (~50 μmolm-2 s-1) ne'ebé fornese hosi OSRAM 116-W halojéniu bulb sira (RS Components, UK) durante loron 3 to'o 5 to'o mosu kolónia ida de'it. Kolónia ida de'it maka uza hodi inokula 10 ml husi meiu M22+ (41) ne'ebé suplementa ho 0.1% (p/v) casamino acids (iha ne'e refere hanesan M22). Kultura ne'e kuda iha kondisaun oksijéniu ne'ebé ki'ik iha nakukun iha 34°C ho nakdoko iha 180 rpm durante oras 48, no depois 70 ml husi kultura ne'e inokula iha kondisaun hanesan durante oras 24. Kultura semi-aeróbiku ho volume 1 ml uza hodi inokula 30 ml hosi médiu M22 iha botir vidru transparente ho parafuzu universál 30 ml no irradia ho agitasaun (~50μmolm-2 s-1) durante oras 48 ho forsa magnétika estéril Stirring rod. Hafoin 30 ml husi kultura inokula ho besik litru 1 husi kultura iha kondisaun hanesan, ne'ebé uza hodi inokula besik litru 9 husi kultura ne'ebé ilumina iha ~200 μmolm-2 s-1 durante oras 72 nia laran. Sélula sira hetan kolleita liuhosi sentrifugasaun iha 7132 RCF durante minutu 30, suspende fali iha ~10 ml husi 20 mM tris-HCl (pH 8.0), no rai iha -20°C to'o presiza.
Hafoin deskongela, aumenta kristal balun husi deoksiribonuklease I (Merck, Reinu Unidu), lisozima (Merck, Reinu Unidu) no tablet inibidor protease holoenzima Roche rua (Merck, Reinu Unidu) ba iha sélula sira ne'ebé resuspende. Iha sélula presaun franseza 20,000 psi (Aminco, EUA), sélula sira hetan perturbasaun dala 8 to'o 12. Hafoin hasai tiha sélula sira ne'ebé la kotu no detritu sira ne'ebé la rezolve liuhosi sentrifugasaun iha 18,500 RCF durante minutu 15 iha 4°C, membrana ne'e presipita hosi lisadu pigmentadu liuhosi sentrifugasaun iha 113,000 RCF durante oras 2 iha 43,000°C. Soe frasaun soluvel no suspende fali membrana kór iha 100 to'o 200 ml tris-HCl 20 mM (pH 8.0) no halo omojeneizasaun to'o laiha agregadu vizivel. Membrana ne'ebé suspende inkuba iha 20 mM tris-HCl (pH 8.0) (Anatrace, EUA) ne'ebé kontein 2% (p/v) β-DDM durante oras 1 iha nakukun iha 4°C ho agitasaun ne'ebé kmaan. Hafoin sentrifuga iha 70°C hodi disolve 150,000 RCF iha 4°C durante oras 1 hodi hasai residuál insoluvel sira.
Membrana solubilizasaun husi estirpe ΔpufW aplika ba koluna troka ion Sepharose DEAE 50 ml ho volume koluna tolu (CV) husi tampón ligasaun [20 mM tris-HCl (pH 8.0) ne'ebé kontein 0.03% (p / v) β-DDM]. Fase koluna ho tampón ligasaun CV rua, no hafoin fase koluna ho tampón ligasaun rua ne'ebé kontein 50 mM NaCl. Komplexu RC-LH116 hetan eluisaun ho gradiente lineár 150 to'o 300 mM NaCl (iha tampón ligasaun) iha 1.75 CV, no kompleksu ligasaun restu hetan eluisaun ho tampón ligasaun ne'ebé kontein 300 mM NaCl iha 0.5 CV. Halibur espektru absorsaun entre 250 no 1000 nm, mantein frasaun ho rásiu absorsaun (A880/A280) boot liu 1 iha 880 to'o 280 nm, dilui dala rua iha tampón ligasaun, no uza fali prosedimentu hanesan iha koluna DEAE Iha purifikasaun. Dilui frasaun sira ho rasio A880/A280 aas liu 1.7 no rasio A880/A805 aas liu 3.0, hala'o ronda datoluk troka ion nian, no mantein frasaun sira ho rasio A880/A280 aas liu 2.2 no rasio A880/A805 aas liu 5.0.0. Komplexu ne'ebé parsialmente purifikadu konsentra ba ~2 ml iha filtru sentrifuga Amicon 100,000 molecular weight cut-off (MWCO) (Merck, UK), no karrega iha koluna eskluzaun ho medida Superdex 200 16/600 (GE Healthcare, US) ne'ebé kontein 200 mM NaCl, hafoin eluídu iha tampón hanesan. CV. Halibur espektru absorsaun sira hosi frasaun eskluzaun medida nian, no konsentra espektru absorsaun sira ho rásiu A880/A280 liu 2.4 no rásiu A880/A805 liu 5.8 to'o 100 A880, no uza kedas sira ba preparasaun grid krio-TEM ka armazenamentu Mantein iha -80°C ne'ebé presiza to'o presiza.
Membrana solubilizasaun husi estirpe PufW-His aplika ba koluna Sepharose HisPrep FF Ni-NTA 20 ml (20 mM tris-HCl (pH 8.0) ne'ebé kontein 200 mM NaCl no 0.03% (p/p)) iha tampón IMAC (GE Healthcare). v) β-DDM]. Koluna ne'e fase ho CV lima husi tampón IMAC, no depois ho CV lima husi tampón IMAC ne'ebé kontein histidina 10 mM. Komplexu núkleu nian elui hosi koluna ho tampón IMAC lima ne'ebé kontein histidina 100 mM. Frasaun ne'ebé kontein kompleksu RC-LH114-W konsentra to'o ~10 ml iha tanki agitadu ne'ebé ekipadu ho filtru Amicon 100,000 MWCO (Merck, UK), diluídu dala 20 ho tampón ligasaun, no hafoin aumenta ba 25 ml Iha koluna DEAE Sepharose, tampón CV haat ne'ebé uza ba tampón b avansadu. Fase koluna ho tampón ligasaun CV haat, hafoin elui kompleksu iha CV ualu iha gradiente lineár 0 to'o 100 mM NaCl (iha tampón ligasaun), no CV haat restu ne'ebé kontein tampón ligasaun 100 mM Komplexu residuál sira ne'ebé elui iha kloridu sódiu kombina ho rasio A8888 no A2080 aas liu duké 2004. Rasio A880/A805 aas liu 4.6 frasaun sira konsentra ba ~2 ml iha filtru sentrifuga Amicon 100,000 MWCO, no nakonu ho 1.5 CV IMAC antesipadu. Halibur espektru absorsaun sira hosi frasaun sira eskluzaun-tamañu nian no konsentra espektru absorsaun sira ho rásiu A880/A280 liu 2.1 no rásiu A880/A805 liu 4.6 to'o 100 A880, ne'ebé uza kedas ba preparasaun grella TEM konjeladu ka rai iha -80°C to'o nesesidade.
Konjelador imersaun Leica EM GP ida uza hodi prepara grella TEM ho temperatura ki'ik. Komplexu ne'e diluídu iha tampón IMAC ba A880 husi 50, no depois 5μl karrega iha malha kobre ne'ebé taka ho karbonu QUANTIFOIL 1.2/1.3 (Agar Scientific, UK). Inkuba grella iha 20°C no 60% umidade relativa durante 30 s, hafoin hamoos maran durante 3 s, no hafoin hamate iha etana líkidu iha -176°C.
Dadus husi kompleksu RC-LH114-W rejista iha eBIC (Sentru Bioimajen Eletróniku) (British Diamond Light Source) ho mikroskópiu Titan Krios, ne'ebé funsiona ho tensaun aselerasaun 300kV, ho magnifikasaun nominal 130,000× no enerjia ho lakuna 200V. Gatan 968 GIF Quantum ho detektor piku K2 uza hodi grava imajen sira iha modo kontajen hodi halibur dadus. Medida pixel ne'ebé kalibradu maka 1.048Å, no taxa doze maka 3.83 e-Å-2s-1. Halibur filme iha segundu 11 no fahe ba parte 40. Uza área ne'ebé taka ho karbonu hodi foka fali mikroskópiu, no hafoin halibur filme tolu kada kuak. Iha totál, filme 3130 maka halibur, ho valór defoku entre -1 no -3μm.
Dadus ba kompleksu RC-LH116 halibur uza mikroskópiu hanesan iha Laboratóriu Bioestrutura Asterbury (Universidade Leeds, Reinu Unidu). Dadus sira halibur iha modo kontajen ho magnifikasaun 130 k, no medida pixel nian kalibra ba 1.065 Å ho doze 4.6 e-Å-2s-1. Filme ne'e grava iha segundu 12 no fahe ba parte 48. Iha totál, filme 3359 maka halibur, ho valór defoku entre -1 no -3μm.
Prosesamentu dadus hotu-hotu hala'o iha pipeline Relion 3.0 (42). Uza Motioncorr 2 (43) hodi hadi'a movimentu raiu nian liuhosi ponderasaun doze nian, no depois uza CTFFIND 4.1 (44) hodi determina parámetru CTF (funsaun transferénsia kontraste nian). Fotomikrografia típiku sira hafoin faze prosesamentu inisiál sira-ne'e hatudu iha Figura 2. S16. Modelu selesaun automátiku nian maka hamosu liuhosi hili manualmente besik 250 pixel hosi partikula 1000 iha kuadru 250-pixel no laiha referénsia ba klasifikasaun dimensaun rua (2D), nune'e rejeita klasifikasaun sira ne'ebé maka hasoru kontaminasaun amostra nian ka laiha karakterístika ne'ebé maka bele haree. Hafoin, selesaun automátika hala'o iha mikrofotografia hotu-hotu, no RC-LH114-W maka partikula 849,359, no kompleksu RC-LH116 maka partikula 476,547. Partíkula hotu-hotu ne'ebé maka hili liu ona ronda rua hosi klasifikasaun 2D la'ós-referénsia, no hafoin hala'o ida-idak, partikula sira ne'ebé maka hasoru área karbonu, kontaminasaun amostra, laiha karakterístika evidente ka partikula sira ne'ebé maka sobrepoin maka'as maka rejeita, hodi rezulta iha 772,033 (90.9%) no 359,678 (75.55) partikula sira maka uza ba klasifikasaun 3D D. RC-LH114-W no RC-LH116 respetivamente. Modelu referénsia 3D inisiál maka hamosu uza métodu desizaun gradiente estokástiku. Uza modelu inisiál hanesan referénsia, partikula sira ne'ebé maka hili klasifika ba kategoria haat iha 3D. Uza modelu iha kategoria ida-ne'e hanesan referénsia, hala'o refinamentu 3D iha partikula sira iha kategoria boot liu, hafoin uza filtru low-pass inisiál 15Å hodi taka área solvente nian, aumenta pixel 6 hosi ninin sira ne'ebé kmaan, no pós-prosesu pixel sira hodi hadi'a funsaun transferénsia modulasaun piku Gatan K2 hosi detetór leten. Ba konjuntu dadus RC-LH114-W, modelu inisiál ida-ne'e modifika liuhosi hasai densidade maka'as iha máskara nia ninin sira (desliga hosi densidade kompleksu núkleu iha UCSF Chimera). Modelu sira ne'ebé rezulta (rezolusaun sira husi RC-LH114-W no RC-LH116 maka 3.91 no 4.16 Å, respetivamente) uza hanesan referénsia ba ronda daruak husi klasifikasaun 3D. Partíkula sira ne'ebé uza agrupa iha klase 3D inisiál no la kontein korelasaun maka'as ho bairru. Sobrepozisaun ka falta karakterístika estruturál sira ne'ebé klaru. Hafoin ronda daruak hosi klasifikasaun 3D, hili kategoria ho rezolusaun aas liu [Ba RC-LH114-W, kategoria ida maka partikula 377,703 (44.5%), ba RC-LH116, iha kategoria rua, hamutuk partikula 260,752 (54.7% W), bainhira de'it sira liña hanesan de'it. rotasaun inisiál ho diferensa ki'ik]. Partíkula sira ne'ebé maka hili ona hasai fali iha kaixa 400-pixel no refina liuhosi refinamentu 3D. Máskara solvente nian maka hamosu uza filtru low-pass inisiál 15Å, espansaun mapa 3 pixel no máskara kmaan 3 pixel. Uza refinamentu CTF kada partikula, koresaun movimentu kada partikula no ronda daruak husi refinamentu CTF kada partikula, refinamentu 3D, máskara solvente no pós-prosesamentu hala'o hafoin etapa ida-idak hodi refina liután testura ne'ebé rezulta. Uza valór FSC (Fourier Shell Correlation Coefficient) 0.143, rezolusaun sira hosi modelu finál sira hosi RC-LH114-W no RC-LH116 maka 2.65 no 2.80Å, respetivamente. Kurva FSC husi modelu finál hatudu iha Figura 2. S17.
Sekuénsia proteína hotu-hotu download hosi UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProtID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) uza hodi konstrui modelu omolojia ida husi RC, ne'ebé kontein sekuénsia proteína sira husi RC-L, RC-M no RC-H no estrutura kristal husi Rba. sphaeroides RC uza hanesan modelu (PDB ID: 5LSE) (46). Uza ferramenta "mapa ajustamentu" iha UCSF Chimera hodi ajusta modelu ne'ebé maka hamosu ba mapa (47), hadi'a estrutura proteína, no kofatór [4×BChl a (naran rezíduu biblioteka monómeru = BCL), 2×BPh a (BPH), tipu ida ka rua husi UQ10 (U10), ferru la'ós-heme ida (Fe) no 34 hexa-hidrokarilina (QAK)] uza Coot (48) hodi aumenta. Tanba QAK la disponivel iha biblioteka monómeru nian, ida-ne'e hetan parametrizasaun uza ferramenta eLBOW iha PHENIX (49).
Tuir mai, konstrui ona subunidade LH1. Iha inisiu, ferramenta konstrusaun automátika iha PHENIX (49) uza hodi konstrui automatikamente parte ida hosi sekuénsia LH1 uza mapa no sekuénsia proteína LH1-α no LH1-β hanesan input. Hili subunidade LH1 ne'ebé kompletu liu, hasai no hatama ba Coot, aumenta manualmente sekuénsia ne'ebé laiha iha laran, no hadi'a manualmente estrutura tomak molok aumenta BCl rua a (BCL) no espiriloxantina ida (CRT) [tuir Rps relevante Densidade kompleksu LH1 no konteúdu karotenoide ne'ebé koñesidu. Espésie (17)]. Kopia subunidade LH1 kompletu, no uza UCSF Chimera “Docking Map Tool” hodi atraka iha área la'ós modelu ne'ebé besik ho densidade LH1, no depois hadi'a iha Coot; repete prosesu to'o subunidade LH1 hotu-hotu modela ona. Ba estrutura RC-LH114-W, liuhosi hasai densidade ne'ebé la aloka iha Coot, proteína ne'e segmenta hosi komponente sira seluk ne'ebé la'ós proteína iha mapa USCF Chimera no ferramenta Autobuild uza hodi estabelese modelu inisiál, no modelajen subunidade sira seluk (proteína-W). Iha PHENIX (49). Hatama sekuénsia sira ne'ebé laiha ba modelu rezultadu iha Coot (48), no depois hadi'a manualmente subunidade tomak. Densidade restu ne'ebé la alokadu enkuadra ba kombinasaun lípidu sira (ID biblioteka monómeru PDB nian hosi CDL = CDL, POPC = 6PL no POPG = PGT), deterjente β-DDM (LMT) no molékula UQ10 (U10). Uza optimizasaun PHENIX (49) no optimizasaun manuál iha Coot (48) hodi perfesiona modelu inisiál kompletu to'o estatístika modelu no kualidade vizuál hosi ajustamentu labele hadi'a liután. Ikus liu, uza LocScale (50) hodi hadi'a mapa lokál, no hafoin hala'o siklu sira seluk hodi halo modelajen ba densidade ne'ebé la aloka no optimizasaun automátika no manuál.
Péptidu, kofatór no lípidu no kinona sira seluk ne'ebé maka atraka iha sira nia densidade hatudu iha Figura 1 no 2. S18 to'o S23. Informasaun estatístika husi modelu finál hatudu iha Tabela S1.
Eseptu espesifikasaun seluk, espektru absorsaun UV/Vis/NIR rekolla iha espektrofotometru Cary60 (Agilent, EUA) iha intervalu 1 nm husi 250 nm to'o 1000 nm no tempu integrasaun 0.1s.
Dilui amostra iha kuveta kuartzu ho dalan 2 mm ba A880 husi 1, no halibur espektru absorsaun entre 400 no 1000 nm. Espektru dikróiku sirkulár sira halibur iha espektropolarímetru Jasco 810 (Jasco, Japaun) iha intervalu 1 nm entre 400 nm no 950 nm ho taxa eskaneamentu 20 nm min-1.
Koefisiente estinsaun molar determina liuhosi dilui kompleksu núkleu ba A880 maizumenus 50. Dilui volume 10μl iha tampón ligasaun 990μl ka metanol, no halibur espektru absorsaun imediatamente hodi minimiza degradasaun BChl. Konteúdu BChl hosi amostra metanol ida-idak kalkula hosi koefisiente estinsaun iha 771 nm hosi 54.8 mM-1 cm-1, no koefisiente estinsaun determina ona (51). Fahe konsentrasaun BChl ne'ebé sukat ona ho 32 (RC-LH114-W) ka 36 (RC-LH116) hodi determina konsentrasaun kompleksu sentrál, ne'ebé hafoin uza hodi determina espektru absorsaun hosi amostra hanesan ne'ebé halibur iha koefisiente Extinsaun tampón. paralelu. Sasukat repetidu dala tolu maka foti ba kada amostra, no absorbánsia média hosi másimu BChl Qy uza ba kálkulu. Koefisiente estinsaun RC-LH114-W ne'ebé sukat iha 878 nm maka 3280±140 mM-1 cm-1, enkuantu koefisiente estinsaun RC-LH116 ne'ebé sukat iha 880 nm maka 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 kuantifika tuir métodu iha (52). Ho liafuan badak, HPLC faze inversa (RP-HPLC) hala'o uza sistema HPLC Agilent 1200. Disolve besik 0.02 nmol husi RC-LH116 ka RC-LH114-W iha 50μl husi 50:50 metanol:kloroformu ne'ebé kontein 0.02% (p/v) kloridu férriku, no injeta pre-ekilibradu Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4mml Disolve iha 1-1-1-m. 40°C iha solvente HPLC (80:20 metanol:2-propanol) iha koluna ×25 cm. Halo eluisaun isokrátika iha solvente HPLC ida hodi monitoriza absorbánsia iha 275 nm (UQ10), 450 nm (carotenoids) no 780 nm (BChl) durante oras 1. Piku iha kromatograma 275 nm iha minutu 25.5 integradu, ne'ebé la kontein kompostu sira seluk ne'ebé bele detekta. Área integradu uza hodi kalkula kuantidade molar UQ10 ne'ebé hasai ho referénsia ba kurva kalibrasaun ne'ebé kalkula hosi injesaun padraun puru hosi 0 to'o 5.8 nmol (Figura S14). Amostra ida-idak analiza iha replikadu tolu, no erru ne'ebé relata koresponde ba SD hosi média.
Solusaun ida ne'ebé kontein kompleksu RC-LH1 ho absorsaun Qy másimu 0.1 prepara ho 30 μM reduzidu fuan kuda nian sitokroma c2 (Merck, Reinu Unidu) no 0 to'o 50 μMUQ2 (Merck, Reinu Unidu). Amostra 1-ml tolu prepara iha konsentrasaun UQ2 ida-idak no inkuba durante kalan iha nakukun iha 4°C hodi asegura adaptasaun kompletu ba nakukun molok halo sasukat. Solusaun ne'e hatama iha espektrofotómetru modulár OLIS RSM1000 ne'ebé ekipadu ho 300 nm flame/500 line grating, 1.24 mm entrada, 0.12 mm iha klaran no 0.6 mm saída. Filtru pasajen naruk 600 nm tau iha entrada fototubu amostra nian no tubu fotomultiplikadór referénsia nian hodi esklui naroman eksitasaun nian. Absorbánsia monitoriza iha 550 nm ho tempu integrasaun 0.15 s. Naroman eksitasaun nian hasai hosi 880 nm M880F2 LED (Light Emitting Diode) (Thorlabs Ltd., UK) liuhosi kabel fibra ótika ho intensidade 90% liuhosi kontroladór DC2200 (Thorlabs Ltd., UK) no hasai ba fonte naroman nian ho ângulu 90°. Raiu sasukat nian kontrariu ho espellu hodi fó fila fali naroman ruma ne'ebé maka la absorve inisialmente hosi amostra. Monitoriza absorbánsia 10 s antes iluminasaun 50 s. Hafoin absorvánsia hetan monitorizasaun liután durante 60 s iha nakukun hodi avalia to'o iha ne'ebé maka quinolol hamenus espontaneamente sitokroma c23 + (haree Figura S8 ba dadus brutu).
Dadus sira prosesa liuhosi ajusta taxa inisiál linear ida iha 0.5 to'o 10 s (depende ba konsentrasaun UQ2) no halo média ba taxa sira hosi amostra tolu hotu iha konsentrasaun UQ2 ida-idak. Konsentrasaun RC-LH1 ne'ebé kalkula hosi koefisiente estinsaun respetivu uza hodi konverte taxa ba efisiénsia katalítika, ne'ebé trasa iha Origin Pro 2019 (OriginLab, EUA), no ajusta ba modelu Michaelis-Menten hodi determina valór aparente Km no Kcat.
Ba sasukat absorsaun tranziente, amostra RC-LH1 diluídu ba ~2μM iha tampón IMAC ne'ebé kontein 50 mM ascorbate sódiu (Merck, EUA) no 0.4 mM Terbutin (Merck, EUA). Ásidu askórbiku uza hanesan doadór eletróniku sakrifísiu, no tert-butaclofen uza hanesan inibidor QB hodi asegura katak doadór RC prinsipál mantein redús (katak, la'ós fotooksidadu) durante prosesu sasukat tomak. Maizumenus 3 ml husi amostra aumenta ba sélula rotasaun personalizadu (besik 0.1 m iha diámetru, 350 RPM) ho komprimentu dalan óptiku 2 mm atu asegura katak amostra iha dalan laser iha tempu sufisiente ba adaptasaun nakukun entre pulsasaun eksitasaun. Uza pulsa laser ~100-fs hodi amplifika sistema laser Ti: Sapphire (Spectra Physics, EUA) hodi eksita amostra iha 880 nm ho taxa repetisaun 1 kHz (20 nJ ba NIR ka 100 nJ ba Vis). Molok halibur dadus, espoin amostra ba naroman eksitasaun nian durante minutu 30 resin. Espozisaun sei kauza inativasaun QA (karik hamenus QA dala ida ka dala rua). Maibé favór nota katak prosesu ida-ne'e reversível tanba hafoin períodu naruk ida adaptasaun nakukun nian, RC sei fila fali neineik ba atividade QA. Espektrómetru Helios (Ultrafast Systems, EUA) uza hodi sukat espektru tranziente sira ho tempu atrazu -10 to'o 7000 ps. Uza software Surface Xplorer (Ultrafast Systems, EUA) hodi haketak konjuntu dadus sira, hafoin tau hamutuk no padroniza. Uza pakote software CarpetView (Light Conversion Ltd., Lithuania) hodi uza konjuntu dadus kombinadu hodi hetan espektru diferensiál sira ne'ebé relasiona ho decaimentu, ka uza funsaun ida ne'ebé konvolve esponente oioin ho resposta instrumentu nian hodi enkuadra evolusaun espektrál ho komprimentu onda úniku iha Origin (OriginLab, EUA).
Hanesan temi ona iha leten (53), filme fotosintétiku ida ne'ebé kontein kompleksu LH1 ne'ebé laiha antena RC no LH2 perifériku prepara ona. Membrana ne'e dilui iha 20 mM tris (pH 8.0) no hafoin ne'e karrega iha kuveta kuartzu ho dalan óptiku 2 mm. Pulsu laser 30nJ uza hodi eksita amostra iha 540 nm ho tempu atrazu -10 to'o 7000 ps. Prosesa konjuntu dadus hanesan deskreve ona ba Rps. amostra pal.
Membrana ne'e halo pelet liuhosi sentrifugasaun iha 150,000 RCF durante oras 2 iha 4°C, no depois nia absorvánsia iha 880 nm hetan resuspende iha 20 mM tris-HCl (pH 8.0) no 200 mM NaCl. Disolve membrana hodi kahur neineik iha 2% (p/v) β-DDM durante oras 1 iha nakukun iha 4°C. Amostra ne'e diluídu iha 100 mM triethylammonium carbonate (pH 8.0) (TEAB; Merck, UK) ba konsentrasaun proteína 2.5 mg ml-1 (análize Bio-Rad). Prosesamentu tuirmai hala'o hosi métodu ne'ebé publika ona antes (54), hahú ho diluisaun proteína 50 μg ba totál 50 μl TEAB ne'ebé kontein 1% (p/v) lauradu sódiu (Merck, Reinu Unidu). Hafoin sonikasaun durante 60 s, ida-ne'e redús ho 5 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (Merck, UK) iha 37°C durante minutu 30. Ba S-alkilasaun, inkuba amostra ho 10 mM methyl S-methylthiomethanesulfonate (Merck, UK) no aumenta hosi solusaun stock isopropanol 200 mM durante minutu 10 iha temperatura ambiente. Dijestaun proteolítika hala'o liuhosi aumenta 2 μg mistura trypsin/endoproteinase Lys-C (Promega UK) no inkuba iha 37°C durante oras 3 nia laran. Surfaktante lauradu hasai liuhosi aumenta 50 μl ethyl acetate no 10 μl 10% (v/v) LC grade trifluoroacetic acid (TFA; Thermo Fisher Scientific, UK) no vortex durante 60 s. Separasaun faze nian promove liuhosi sentrifugasaun iha 15,700 RCF durante minutu 5 nia laran. Tuir protokolu fabrikante nian, koluna spin C18 (Thermo Fisher Scientific, UK) uza hodi aspira no hasai masin ho kuidadu faze kraik ne'ebé kontein peptide. Hafoin maran liuhosi sentrifugasaun vákuu, amostra ne'e disolve iha 0.5% TFA no 3% asetonitrilu, no 500 ng analiza liuhosi kromatografia nanoflow RP akompaña ho espektrometria massa uza parámetru sistema nian ne'ebé detalla ona antes.
Uza MaxQuant v.1.5.3.30 (56) ba identifikasaun no kuantifikasaun proteína nian hodi buka Rps. baze-dadus proteoma palustris (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Dadus proteómika espektrometria massa nian depozita ona iha ProteomeXchange Alliance liuhosi repozitóriu parseiru PRIDE (http://proteomecentral.proteomexchange.org) iha identifikadór konjuntu dadus PXD020402 nia okos.
Ba análize liuhosi RPLC ne'ebé akompaña ho espektrometria massa ionizasaun eletrospray, kompleksu RC-LH1 prepara hosi Rps tipu selvajen. Uza métodu ne'ebé publika ona antes (16), konsentrasaun proteína ne'ebé produz iha sélula palustris maka 2 mg ml-1 iha 20 mM Hepes (pH 7.8), 100 mM NaCl no 0.03% (w/v) β- (análize Bio-Rad) ) DDM. Tuir protokolu fabrikante nian, uza kit purifikasaun 2D (GE Healthcare, EUA) hodi hasai proteína 10 μg liuhosi métodu presipitasaun, no disolve presipitadu iha 20 μl 60% (v / v) ásidu fórmiku (FA), 20% (v / v) Acetonitrile no 20% (v/v) bee. Mikrolitru lima maka analiza liuhosi RPLC (Dionex RSLC) ne'ebé akompaña ho espektrometria massa (Maxis UHR-TOF, Bruker). Uza koluna MabPac 1.2×100 mm (Thermo Fisher Scientific, UK) ba separasaun iha 60°C no 100μlmin -1, ho gradiente 85% (v / v) solvente A [0.1% (v / v) FA no 0.02% (V/v) TFA solusaun bee] ba solvente 85% (v / v) [0.1%(v/v) FA no 0.02%(v/v) iha 90%(v/v) asetonitrilu TFA] Uza fonte ionizasaun eletrospray padraun no parámetru padraun sira ba liu minutu 60, espektrómetru massa hetan 100 to'o 2750 m/z (proporsaun karga-massa). Ho tulun husi portál rekursu bioinformátika ExPASy FindPept tool (https://web.expasy.org/findpept/), halo mapa ba espektru massa ba subunidade sira husi kompleksu.
Sélula sira kuda durante oras 72 iha naroman 100 ml NF-ki'ik (10μMm-2 s-1), médiu (30μMm-2 s-1) ka aas (300μMm-2 s-1). M22 médiu (M22 médiu iha ne'ebé sulfatu amóniu la inklui no suksinatu sódiu troka ho asetadu sódiu) iha botir 100 ml ho parafuzu (23). Iha siklu lima ho 30-s, kontas vidru 0.1 mikron nian hetan kontas ho proporsaun volume 1:1 hodi halo lize ba sélula sira no halo malirin iha jelu durante minutu 5. Matéria insolúvel, sélula sira ne'ebé la kotu no kontas vidru nian hasai liuhosi sentrifugasaun iha 16,000 RCF durante minutu 10 iha mikrosentrifuga meza nian. Membrana ne'e haketak iha rotor Ti 70.1 ho 100,000 RCF iha 20 mM tris-HCl (pH 8.0) ho gradiente sukrosa 40/15% (p/p) durante oras 10 nia laran.
Hanesan deskreve ona iha ami nia serbisu anteriór, imunodeteksaun ba His tag iha PufW (16). Ho liafuan badak, kompleksu núkleu ne'ebé purifikadu (11.8 nM) ka membrana ne'ebé kontein konsentrasaun hanesan RC nian (determina hosi oxidasaun ne'ebé hasai espektru diferensa ne'ebé redús no koresponde ho karga iha jeli ne'ebé hetan mancha) iha 2x SDS loading buffer (Merck, UK) ne'ebé diluídu dala rua. Proteina sira haketak iha réplika 12% bis-tris NuPage gel (Thermo Fisher Scientific, UK). Jel ida hetan ko'a ho Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, UK) hodi karrega no vizualiza subunidade RC-L. Proteina iha jeli daruak transfere ba membrana polivinilidenu fluoride (PVDF) ne'ebé ativadu ho metanol (Thermo Fisher Scientific, UK) ba imunoensaiu. Membrana PVDF hetan blokeiu iha 50 mM tris-HCl (pH 7.6), 150 mM NaCl, 0.2% (v / v) Tween-20 no 5% (p / v) susu-been pó, no hafoin inkuba ho antikorpu primáriu anti-His (iha Dilute antikorpu buffer [50 mM tris-HCl (HM 7.6), 150 mM NaCl no 0.05% (v/v) Tween-20] iha 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, EUA) durante oras 4 nia laran. Hafoin fase dala 3 durante minutu 5 iha tampón antikorpu nian, membrana ne'e kombina ho antikorpu sekundáriu anti-mouse peroxidase (Sigma-Aldrich, UK) (diluídu 1:10,000 iha tampón antikorpu nian) Inkuba atu permite deteksaun (minutu 5 hafoin fase dala 3 iha tampón antikorpu nian) uza WAR EST 2000. substratu kimiluminesénsia (Cyanagen, Itália) no Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Reinu Unidu).
Hodi dezeña distribuisaun intensidade husi kada jeli ne'ebé maka manchadu ka liña imunoensaiu nian, integra área iha piku nia okos no kalkula rasio intensidade husi RC-L (jel ne'ebé maka manchadu) no Protein-W (imunoensaiu), iha ImageJ (57) Prosesa imajen. Rasio sira-ne'e konverte ba rasio molar sira hodi asume katak rasio RC-L ba proteína-W iha amostra RC-LH114-W ne'ebé moos maka 1:1 no normaliza konjuntu dadus tomak tuir ida-ne'e.
Ba materiál suplementár sira ba artigu ida-ne'e, favór haree http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1
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David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Andrew C. Hitcher, Necoil Hunter.
Estrutura ho rezolusaun aas hosi kompleksu armadilha naroman 1 iha sentru reasaun nian fornese hanoin foun sira kona-ba dinámika kinona nian.
David JK Swainsbury, Park Qian, Philip J. Jackson, Kaitlyn M. Faries, Dariusz M. Niedzwiedzki, Elizabeth C. Martin, David A. Farmer, Lorna A. Malone, Rebecca F. Thompson, Neil A. Ranson, Daniel P Canniffe , Mark J. Dickman, Dewey Holten, Christine Kirma, Andrew C. Hitcher, Necoil Hunter.
Estrutura ho rezolusaun aas hosi kompleksu armadilha naroman 1 iha sentru reasaun nian fornese hanoin foun sira kona-ba dinámika kinona nian.
©2021 Asosiasaun Amerikana ba Avansu Siénsia nian. direitu hotu-hotu rezervadu. AAAS hanesan parseiru husi HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef no COUNTER. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.